卡拉霉素在转基因黄籽油菜中的应用

为筛选出黄籽油菜遗传转化中卡拉霉素或卡拉霉素(kanamycin,Kan or km)最佳质量浓度,首先将油菜子叶接种在不同质量浓度Kan(0~180mg/L)的分化培养基上,结果发现Kan质量浓度小于60 mg/L有利于绿苗分化.然后在不同质量浓度Kan的分化培养基上对农杆菌侵染的下胚轴进行筛选,结果表明初代培养Kan质量浓度以20~40mg/L为宜,同样质量浓度继代培养后可获得抗性愈伤和转基因阳性苗.最后利用Kan抗性对转基因黄籽油菜后代进行研究,苗期到薹花期生长的植株进行叶片涂抹法筛选,Kan最适质量浓度为4g/L,时间为4~10d;T1代抗性分析、GUS染色分析、T1代籽粒的PCR检测说明转基因在T1代、T2代可遗传并出现分离.β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和聚合酶链式反应(PCR)验证叶片涂抹进行Kan抗性筛选的方法准确性高,可达100%.     

大白菜转基因选择剂卡那霉素的浓度筛选

卡那霉素(Kan)抗性基因的利用是筛选和鉴定转基因植株的有效方法。试验利用不同浓度的Kan作为转基因选择剂,对2个大白菜品系7#和9#的幼苗进行处理,以确定筛选的最佳浓度。结果显示,随着Kan浓度的升高,2个品系的幼苗均表现出子叶黄化率升高、下胚轴变短、鲜质量降低的趋势,且2个品系大白菜幼苗对Kan的敏感性略有不同,7#大白菜的最佳筛选质量浓度为150~175 mg/L,而9#则为200 mg/L。研究结果可为大白菜遗传转化及阳性后代的筛选鉴定奠定基础。     

卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因苜蓿的研究

以田间生长的苜蓿为材料进行卡那霉素(Kan)涂抹叶片筛选转基因植株最佳浓度和适宜观察时间的研究,并对筛选的抗性植株进行了PCR检测验证.结果表明,Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000 mg/L,观察时间以12天为宜;经PCR检测验证,Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8%.研究建立了一种在田间对转基因苜蓿进行大量筛选的简便方法,对于转基因苜蓿材料的选育具有重要利用价值.     

英国薰衣草叶盘遗传转化体系的创建

[目的]以英国薰衣草叶片为材料,创建稳定高效的农杆菌介导薰衣草的遗传转化体系.[方法]未经预培养的英国薰衣草叶片,在OD600=0.4的根癌农杆菌菌液中浸染10 min,共培养1d后,在Cef抑菌浓度为300 mg/L、Kan筛选浓度为30 mg/L的选择培养基上诱导芽分化,抗性芽在Kan浓度为10 mg/L生根培养基上诱导生根.[结果]对筛选得到的65株抗性苗进行PCR检测,获得2株阳性植株,转化率达到3.00;.[结论]建立了稳定高效的农杆菌介导英国薰衣草的遗传转化体系.     

冷诱导基因转化柠檬的研究

将包含载体p Ptcor∷8Ptcor8∷YFP的农杆菌EHA105转入到不抗寒的柠檬中,并对转化体系进行了优化。研究结果表明,再生培养基中的6-BA的浓度,卡那霉素(Kan)浓度以及除草剂(Basta)的浓度对柠檬的转化效率有明显影响;再生培养基配方为MT+0.5 mg/L 6-BA,添加75 mg/L kan或10 mg/L Basta时能够有效筛选到抗性芽,并获得了3株转基因柠檬植株,YFP阳性率为3.6%。     

甘蓝型油菜花柄遗传转化体系的创建

为获得转基因油菜植株,以甘蓝型油菜品种特选4号花柄为外植体,确定了不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L,并进行了花柄外植体的转化试验,得到了抗卡那霉素(Kan)植株,并对影响转化的一些因素进行了研究。结果表明:卡那霉素对芽再生均具有很强的抑制作用,最佳筛选浓度为15mg/L;花柄外植体在MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D培养基上预培养72h时,经农杆菌(OD600≈0.4)侵染3min后共培养2d,获得了抗卡那霉素并通过PCR鉴定和GUS报告基因检测的转基因植株15株,遗传转化效率为5.19%。     

番茄遗传转化与筛选鉴定的改进研究

将At-pri-miR828基因的过表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828通过农杆菌侵染法转入番茄(Solanum lycopersicum L.)品种‘Ailsa Craig’为例,来对番茄的遗传转化过程中番茄种子消毒处理、无菌苗培养、转基因阳性植株的Kan筛选浓度、PCR检测等方法进行研究,旨在探索一套快速高效的番茄遗传转化及鉴定方法。研究发现:采用C_2H_5OH、Na_3PO_3及NaClO分别浸泡及无菌水反复冲洗的种子消毒方法,可使污染率减少到5%以下;种子震荡培养法可以提高发芽率并促进种苗的生长势一致;筛选转基因阳性植株的Kan最佳质量浓度为100mg·L~(-1);100mg·L~(-1)的Kan溶液浇灌蛭石和在MS培养基中添加Kan的方法都可以用来筛选转基因番茄。最终Kan筛选和PCR检测等鉴定方法显示番茄的遗传转化效率为32.5%。     

农杆菌介导EuABP2基因遗传转化杜仲下胚轴研究

为提高农杆菌介导的杜仲下胚轴遗传转化效率,本研究以杜仲种子为材料,采用正交试验设计,研究了NAA浓度、种子切割方式及光照强度对杜仲萌发及下胚轴直径和长度的影响;获得筛选标记草铵膦用于杜仲遗传转化的适宜浓度,并对杜仲抗性芽生根方式进行了优化。结果表明:NAA(0.5 mg/L),正中横切,暗培养15 d,能有效的促进杜仲种子萌发及下胚轴的生长。本试验条件下杜仲种子萌发率可达95%,下胚轴直径1.21 mm,长度22.5 mm;以0.25 mg/L的草铵膦能够对杜仲转基因抗性芽进行有效筛选;成功获得转EuABP2基因表达的杜仲转基因植株12株。     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

辽棉19号转化耐盐基因AlNHX1的研究

为提高辽宁棉花品种的耐盐性,利用农杆菌介导上胚轴外植体转化法,将来源于盐生植物獐茅的Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)导入棉花辽棉19号中,分析影响棉花上胚轴外植体农杆菌转化的几个重要因素,建立并优化了该品种的转化体系,结果表明:1)农杆菌侵染的最佳时间为90s,共培养过程中乙酰丁香酮最适浓度为100 mg/L,筛选培养基中潮霉素最适浓度为30 mg/L,生根培养基中吲哚乙酸IBA的最适浓度为10mg/L;2)对转化植株进行PCR检测,表明耐盐基因AlNHX1已导入辽棉19号中;3)在盐胁迫下,转基因植株的电导率,渗透势都显著低于未转化植株。结果表明,通过筛选并优化转化体系,辽棉19号品种的耐盐性有较明显的提升,为沿海滩涂地区种植棉花提供了一定的参考。     

产肠毒素大肠杆菌K88ac-STⅡ-LTA2/LTB融合基因在苜蓿中的表达

为提高农杆菌介导的苜蓿遗传转化效率,获得转K88ac-STⅡ-LTA2/LTB基因苜蓿植株,以苜蓿下胚轴为外植体,对影响遗传转化的预培养时间、农杆菌菌液浓度、筛选方式等进行研究.结果表明,苜蓿下胚轴预培养3 d,菌液浓度为OD6000.5,筛选剂Kan浓度第一阶段和第二阶段分别为30和50 mg/L ,延迟筛选7 d时转化效率最高.对转基因苜蓿进行PCR和PT-PCR检测,初步证实目的基因已经整合到苜蓿基因组中,转化率达28.4%.     

以诺丽茎段为外植体的无籽基因转化研究

以诺丽无菌苗不带腋芽的茎段为转化材料,采用根癌农杆菌介导法,将含有无籽基因的质粒pCAMBIA1305.1导入到诺丽细胞中,通过Kan快速筛选、PCR检测等方法对转化子进行鉴定.实验结果表明:抗性芽的平均分化频率为42%,经过PCR检测,以茎为外植体进行遗传转化的转化率为5.4%.在转化过程中,有些植株可能会发生饰变.该实验初步证实已把无籽基因转入诺丽,后续需Southern杂交进一步验证.     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

颠茄高频再生体系的建立及卡那霉素抗性筛选（摘要）

[目的]建立颠茄高频再生体系及筛选卡那霉素（Kan）抗性。[方法]以颠茄叶片及腋芽为外植体,研究了培养基中6-BA和NAA不同配比对其不定芽分化的影响以及叶片不定芽对Kan的敏感性。[结果]MS＋4.5mg/L6-BA＋0.2mg/LNAA为叶片不定芽分化的最佳培养基,不定芽分化率达100%,在1.0cm×1.0cm叶块上的不定芽分化数平均达5.85;MS＋3.0mg/L6-BA＋0.1mg/LNAA为腋芽不定芽分化的最适培养基,不定芽分化率达100%,每个腋芽不定芽分化平均数为4～8个;400.0mg/LKan为颠茄叶片遗传转化的最佳筛选浓度。[结论]为颠茄无菌苗的快速繁殖以及基于叶盘法的遗传转化奠定了基础。     

3种地锦草总黄酮和鞣质质量分数及体外抗菌活性比较

采用紫外-可见分光光度法测定陕西产地锦、斑地锦、小叶地锦总黄酮和鞣质质量分数,应用微量肉汤稀释法测定其在体外对大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)。结果表明,地锦、斑地锦、小叶地锦的总黄酮质量分数分别为16.53、18.62、22.65mg/g,鞣质质量分数分别为38.31、32.78、41.44mg/g。地锦、斑地锦、小叶地锦对大肠埃希菌MIC、MBC均为125g/L,对鼠伤寒沙门菌MIC分别为62.5、31.25、62.5g/L,MBC分别为125、62.5、250g/L,对金黄色葡萄球菌MIC分别为125、31.25、62.5g/L,MBC分别为250、125、62.5g/L,对无乳链球菌MIC分别为125、62.5、125g/L,MBC分别为125、250、125g/L。陕西产斑地锦,尤其是小叶地锦为中药地锦草的潜在新基原。     

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。     

4种微量元素对蒙古黄芪幼苗形态建成及抗逆性的影响

微量元素在种子萌发过程中通过影响种子内的酶系统,促进种子内贮藏物质的分解,影响种子的萌发和幼苗的生长、生理。以蒙古黄芪(Astragalus membranaceus Bge.)为对象,研究Fe、Zn、Mn、Cu对蒙古黄芪种子萌发、幼苗生长和部分生理特性的影响。结果表明,一定质量浓度的微量元素处理能够显著促进蒙古黄芪种子的萌发,提高种子活力,促进黄芪幼苗的生长。进一步的研究表明,200mg/L FeSO4、50mg/L ZnSO4、250mg/L MnSO4和200mg/L CuSO4处理的黄芪幼苗子叶叶绿素含量最高;800mg/L FeSO4、50mg/L ZnSO4、500mg/L MnSO4和200mg/L CuSO4处理的黄芪幼苗根系相对电导率最低,根系活力最佳,说明微量元素处理减少了黄芪幼苗根系质膜所受的伤害,提高了根系抗逆性;400mg/L FeSO4、100mg/L ZnSO4、125mg/L MnSO4和25mg/L CuSO4处理的黄芪幼苗SOD和POD活性最佳。说明一定质量浓度的微量元素处理能够提高黄芪幼苗的抗逆性。     

半夏再生体系的建立

【目的】优化半夏再生条件,以获得优质半夏种苗.【方法】筛选出适宜的外植体后,使用3种激素2,4-D,KT,IAA利用正交设计法设置9个处理组对半夏愈伤组织进行诱导.选取长势良好,大小均一的半夏愈伤组织接于4种培养基中进行愈伤组织增殖.选取半夏叶柄诱导出的愈伤组织将其接于5种培养基中进行愈伤组织分化,观察不同培养基对半夏愈伤组织生根和出芽的影响,最后进行炼苗与移栽.【结果】在叶柄、叶片及块茎3种外植体中,叶柄是半夏愈伤组织诱导的最佳外植体;最有利于半夏愈伤组织诱导的培养基为MS+0.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L KT+1.0 mg/L IAA;在暗培养条件下,将半夏愈伤组织继代于MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IAA中生长最快;MS+0.2 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA培养基最有利于半夏愈伤组织的生根和出芽.