适配体制备技术及其在农产品化学污染物检测中的应用

通过指数富集配体系统进化技术筛选的核酸适配体,依靠其特定的三维结构可以和包括小分子、蛋白、核酸,甚至细胞、组织等在内的各种靶分子高亲和力高特异性结合。与传统识别分子抗体相比,具有制备简单、性能稳定、便于标记等优点,成为分析化学领域一种新的分析工具。本文综述了适配体制备技术以及适配体在农产品中农兽药残留、违禁添加物、生物毒素检测方面的应用研究进展。     

适配体在生物毒素检测中的应用进展

食物中毒是一类重要的食源性疾病,近年来由生物毒素引起的食物中毒事件频繁出现,引起了社会广泛关注,对于食品中生物毒素的快速、高效检测提出了更高要求。在众多快速检测技术中,基于适配体的检测方法是目前的研究热点之一。作为新型识别工具,适配体具有特异性强、亲和力高、制备成本低等明显优势,已被应用于食品中危害物质的识别检测。对适配体及其在各类生物毒素检测中的应用进行综述,并对该技术存在的问题及其发展方向进行探讨,以期促进基于适配体的检测方法在生物毒素快速检测中得到进一步的推广和应用。     

基于复合纳米材料和酶切信号放大电化学适体传感器检测沙门氏菌

【目的】沙门氏菌是食品中致病菌检测的一项重要指标。本研究拟构建一种实用性更强的用于沙门氏菌检测的新型电化学适配体传感器,以克服各种沙门氏菌传统检测方法的缺陷。【方法】通过混合还原氧化石墨烯(rGO)溶液与甲苯胺蓝(Tb)溶液制得Tb-rGO复合物,再将此复合物分散于纳米金(Au NPs)溶胶中得到Au NPs-Tb-rGO复合物。最后将Au NPs-Tb-rGO复合物与带有氨基的DNA链(S1)孵育得DNA-复合纳米材料(S1-Au NPs-Tb-rGO)。通过金硫键将沙门氏菌适配体互补链(S2)修饰在金电极表面,以己硫醇为封闭剂消除非特异性吸附后,滴涂沙门氏菌适配体(Apt)于电极表面,使Apt与S2杂交结合。将修饰好的电极浸入含有沙门氏菌与核酸外切酶I(Exo I)的混合液中,基于Exo I信号放大效应,利用适配体对沙门氏菌的特异性结合作用,循环带离适配体,再通过S1-Au NPs-Tb-rGO中的S1与S2杂交将S1-Au NPs-Tb-rGO负载到电极表面,监测电极表面的电化学信号,并对在菌液中的孵育时间、Exo I浓度和S1-Au NPs-Tb-rGO浓度进行优化,构建沙门氏菌电化学适配体传感器。使用该传感器,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌进行检测,以确定沙门氏菌电化学适配体的特异性;对6×10~2—6×10~6 cfu/mL的沙门氏菌进行检测,以确定沙门氏菌电化学适配体传感器的敏感性;对羊奶样品进行检测,以确定沙门氏菌电化学适配体传感器的实用性。【结果】所建立的沙门氏菌电化学适配体传感器在菌液中的最佳孵育时间为1 h,Exo I的最适浓度为0.6 U·μL~(-1),S1-Au NPs-Tb-rGO的最适浓度为200 nmol·L~(-1)。在进行沙门氏菌的检测时,沙门氏菌与Apt特异结合,S1-Au NPs-Tb-rGO复合纳米材料被结合到电极表面使其线性伏安曲线氧化峰升高。特异性试验结果表明,所建立的方法仅对沙门氏菌的检测有电信号响应,而对非目标菌无响应。敏感性试验结果表明,所构建的沙门氏菌电化学适配体传感器,具有很高的敏感性,对沙门氏菌检测的敏感性达200 cfu/mL。使用建立的沙门氏菌电化学适配体传感器对羊奶中的沙门氏菌含量进行测定,加标回收率在91.6%—106.3%,结果令人满意。【结论】所建立的沙门氏菌电化学适配体传感器具有操作简便、检测范围宽、检出限低和成本低廉等优点,有望应用于食品工业中沙门氏菌的现场快速定量检测。     

以亚甲基蓝为杂交指示剂的电化学适配体鼠伤寒沙门氏菌传感技术

【目的】构建一种更具实用性的可定量检测鼠伤寒沙门氏菌的新型电化学适配体传感器,克服传统沙门氏菌检测方法在时效性、灵敏度和操作简便性等方面的不足。【方法】将反应制得的氧化石墨烯（GO）滴涂在玻碳电极（GCE）表面,于PBS缓冲液中采用电化学还原法将其还原为还原氧化石墨烯（rGO）,随后放置电极于氯金酸溶液中进行电沉积,于表面修饰一层纳米金（AuNPs）。依靠金硫键的作用将鼠伤寒沙门氏菌适配体互补链（S）固定在电极上,滴加封闭剂巯基己醇（MCH）占据电极表面空余位点,保证电极无非特异性吸附后,再将鼠伤寒沙门氏菌适配体（Apt）滴涂于电极表面,使S与Apt杂交形成DNA双链结构。将电极于37℃下同鼠伤寒沙门氏菌与核酸外切酶I（Exo I）的混合液孵育,依靠鼠伤寒沙门氏菌与Apt高度特异性结合,将Apt从电极表面带离,再基于Exo I对单链DNA的剪切作用,使鼠伤寒沙门氏菌得以循环重复作用于适配体,再将电极浸入亚甲基蓝（MB）溶液一段时间后,通过监测电极表面的电信号,并对其在菌液中的孵育时间及Exo I的浓度进行优化,构建检测鼠伤寒沙门氏菌的新型电化学适配体传感器。使用构建的传感器对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌以及副溶血弧菌进行检测,以确定该传感器的特异性;对2×10²-2×10⁷ cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌进行检测,以确定该传感器的敏感性;对猪肉样品进行鼠伤寒沙门氏菌的定量检测,以确定该传感器的实用性。【结果】所构建的鼠伤寒沙门氏菌电化学适配体传感器在菌液中的最适孵育时间为40 min,Exo I的最适浓度为0.8 U·µL^-1。特异性试验结果表明,该传感器仅在鼠伤寒沙门氏菌存在时有电信号响应,而对非目标菌无响应。敏感性试验结果表明,该传感器具有很高的敏感性,对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性可达67 cfu/mL。使用构建的鼠伤寒沙门氏菌电化学适配体传感器对猪肉中的鼠伤寒沙门氏菌进行定量检测,加标回收率在97.3%-106.7%。【结论】所构建的新型鼠伤寒沙门氏菌电化学适配体传感器具备灵敏度高、特异性强、易于操作、检测迅速及成本低廉等优点,有望应用于食品工业中鼠伤寒沙门氏菌的现场快速定量检测。     

核酸适配体技术在食品有害物检测中的研究进展

核酸适配体是一段可以特异性识别并结合靶分子的寡聚核苷酸片段,具有亲和力强、稳定性好、易于修饰等特点,已经广泛用于检测、分离纯化和医疗三大领域。基于核酸适配体技术的检测方法得到了迅速地发展,已经应用于小分子、蛋白质、细菌病毒等方面的检测。主要综述了核酸适配体检测食品中有害物的研究进展。     

基于表面等离子体共振的核酸传感器研究进展

表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器是一种基于物理光学原理的新型生化分析系统。近年来,因其具有无需标记、高灵敏度、高特异性、实时和快速等优势而广泛应用于各个领域,如临床诊断、转基因成分定性及定量检测、病毒鉴定、环境微生物检测、药物筛选及遗传分析等。它在不需要标记甚至无需纯化生物组分的天然条件下,将核酸探针作为识别因子修饰到传感器芯片表面上,并可实时监测一些特殊的分子互作信息。然而,基于SPR技术的核酸传感器鲜有系统性的报道,因此对有关表面等离子体共振现象的形成及其作为核酸敏感检测手段的原理、应用及发展趋势等问题作了简要的介绍,旨在为生物传感研究提供相应的参考依据。     

基于核酸适配体的阳离子聚合物聚集纳米金比色法检测水中睾酮

利用核酸适配体对睾酮特异性识别功能以及阳离子聚合物PDDA(poly dimethyl diallyl ammonium chloride,PDDA)聚集纳米金特性,建立了一种高灵敏度、高特异性测定睾酮的定量方法。在最优实验条件[10 mmol/L PB缓冲溶液(pH 7.4),孵育温度25℃,6nmol/L PDDA,6nmol/L睾酮核酸适配体]下,体系吸光度比值A_(650)/A_(520)与睾酮浓度C呈良好的线性关系,决定系数R2为0.995。该方法可检测睾酮浓度范围为2.27nmol/L~1.8μmol/L,最低检测限为2.27nmol/L,将本方法应用于检测自来水睾酮含量,加标回收率为99.81%~105.04%。本方法具有检测范围广、成本低、操作简便、检测灵敏等优点,具有良好实际应用前景。     

适配体传感器结合便携式血糖仪定量检测赭曲霉毒素A的方法研究

目前大多数小分子毒素的定量检测方法仍需以实验室为基础或者定制设备,不能被公众广泛应用。研究开发了一种便携式适配体生物传感器,结合血糖仪用于赭曲霉毒素A(OTA)的定量检测。所开发的适配体生物传感器的线性范围是1×10-8~4×10-6mol/L,检出限6.7×10-9mol/L(2.69μg/kg);适配体生物传感器被成功地应用于婴幼儿米粉和羊草样品检测,回收率达84%~122%,表明所开发的适配体生物传感器为OTA的定量检测提供了一种新的方法,展现出良好的应用前景。     

基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

[目的]比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A(OTA)方法与酶联免疫法。[方法]建立核酸适配体检测OTA标准曲线,进行样品加标回收率试验,并与酶联免疫法进行比较。[结果]核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性,饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%,与酶联免疫法相比,2种方法之间具有较好的一致性。[结论]该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好,为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。     

利用PicoGreen作为检测探针建立基于核酸适配体识别的玉米赤霉烯酮快速检测方法

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种能对动物和人类产生毒性的真菌毒素。研发灵敏而准确的玉米赤霉烯酮快速检测技术对于保障食品动物安全至关重要。该研究以PicoGree荧光染料为检测探针,利用其仅与dsDNA结合后才发出荧光的特性(激发波长:480nm,发射波长:520nm),当ZEN不存在时,适配体能够与其互补链结合而形成dsDNA,导致荧光强度增强;当ZEN存在时,适配体与ZEN结合而不能形成dsDNA,导致荧光强度减弱。建立了一种基于核酸适配体识别的ZEN快速检测方法。灵敏度试验表明:该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1ppb),线性范围为0.1~1μg/L(0.1~1ppb)。检测时间可以控制在40min内。特异性试验结果表明:ZEN核酸适配体与桔青毒素(CTN)、赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B_1(AFB_1)和伏马毒素B_1(FB_1)等真菌毒素不会出现交叉反应。本研究与传统的基于抗体识别的ELISA快检方法进行比较,Kappa值为0.805,表明二者一致性相当。由于核酸适配体价廉,检测时间短,因此本文开发的ZEN检测方法较常用的ELISA方法更具有推广和应用价值。     

全自动荧光酶联免疫方法检测食品中沙门氏菌

应用全自动荧光酶联免疫（VIDAS）方法和GB/T4789.4-2003对沙门氏菌进行检测,对其灵敏性和特异性进行比较。当样品中细菌含量只有3CFU/25g时,VIDAS方法的检出率达到90%,其中活菌的检测限为4CFU/25g;且用该方法检测沙门氏菌属和非沙门氏菌属标准株的特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。结果表明,该方法具有简单、快速、特异性好和敏感性高等特点,并可满足大批样品沙门氏菌筛选检测的要求,适用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

食品中沙门氏菌检测方法的探讨

介绍了沙门氏菌污染的危害,并探讨了几种主要的检测方法。这些快速检测方法对于沙门氏菌的检测具有良好的应用前景。     

溶藻弧菌适配子亲和力测定条件的优化及其特异性研究

[目的]优化溶藻弧菌适配子亲和力的测定条件,并验证适配子的亲和特异性。[方法]采用地高辛-过氧化物酶显色系统,通过正交试验确定亲和力测定的适宜条件,并在该条件下进行特异性验证。[结果]优化后亲和力的测定条件为：菌浓度3.0×10^8个/ml,结合时间40 min,结合温度28℃;经验证,该适配子对溶藻弧菌具有较高的亲和特异性。[结论]获得了溶藻弧菌适配子亲和力测定的优化条件,并证明了该适配子与溶藻弧菌具有较好的亲和特异性,为溶藻弧菌的SELEX筛选及其快速检测提供了参考。     

基于适配体的光学和电化学法对食源性致病菌检测的研究进展

由于食品的多样性和食品基质的复杂性,食品安全问题已成为全社会共同关注的热点问题,其中微生物引起的食源性疾病居全球食品安全问题之首。食源性致病菌的检测是食源性疾病预防与控制的关键环节。平板计数法被评为微生物检测的金标准,但在致病菌检测过程中信号的放大需要通过单个细胞生长成菌落来实现,因此检测周期较长（3—7 d）。此外,现有的准确检测致病菌的技术有聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）等,但由于预处理时间长、操作复杂、检测结果存在假阳性等问题,不适合对致病菌进行现场快速有效的检测。核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,具有良好的特异性、稳定性、易于修饰和亲和力高等特点,在毒素、抗生素、重金属和致病菌等其他小分子的检测中有很大的潜力。目前,国内外学者已开发了各种基于适配体的检测方法。本文综述了食品中常见的食源性致病菌及其传统的检测方法和近十年来用于致病菌检测的光学和电化学适配传感器,涵盖每种方法的检测策略、检测时间、检测范围和检测限等信息,也提出了适配体传感器在食品安全检测中存在的主要问题,并对其未来研究的发展趋势进行了展望,这些将为今后的研究工作提供一定的基础。     

饲料中沙门氏菌的快速检测方法及预防措施

本文介绍了近些年来饲料中沙门氏菌的检测方法,并提出了预防饲料中沙门氏菌污染的措施,具体包括饲料原料选择、生产加工过程的控制以及包装、运输、储存、使用过程的控制等方面内容,以期为饲料安全生产提供参考。     

2种培养基对乳粉中沙门氏菌的定量检测比较

为了掌握食品中沙门氏菌的定量检测方法,对比不同种类培养基对食品中沙门氏菌定量检验结果的差异,参考国家权威部门提供的乳粉中沙门氏菌标准物质定值实施方案及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》的要求对3份沙门氏菌标准物质样品进行沙门氏菌的定量检测。结果显示,使用XLD培养基和沙门显色培养基,在没有其他干扰菌的情况下,均可对沙门氏菌进行有效的计数。     

百色市动物饲料中沙门氏菌分离鉴定检测报告

随机抽查百色市2009—2012年468份饲料进行沙门氏菌的检测,通过预增菌、选择性增菌和分离培养鉴定,检出阳性样品7份,阳性率1.5%。其中猪浓缩饲料样品检出5份,鸡配合饲料样品检出1份,自配大鸡混合饲料检出1份。检测发现猪浓缩饲料检出的几率较高,鸭、鱼、兔配合料未检出阳性样品,饲料中沙门氏菌污染主要来源于添加的动物蛋白质原料,添加动物蛋白质原料比例越高,检出的几率越大。     

畜产品中沙门氏菌的快速检测

以热裂解法快速提取DNA模板,应用PCR技术检测沙门氏菌,22种沙门氏菌的基因均获得特异性扩增(496bp),5种非沙门氏菌检测结果为阴性。试验结果表明,PCR是一种快速、敏感和高度特异性的沙门氏菌检测方法,值得在畜产品沙门氏菌的检测中推广应用。