泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃细菌群落组成与多样性变化

本研究旨在探究泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃细菌群落组成及其多样性的变化。共设置2个试验：试验1，选取20头泌乳中期健康高产荷斯坦奶牛，饲喂相同饲粮，持续8周，分别在第0、4、7周的第7天采集瘤胃内容物；试验2，选取30头泌乳中期健康高产荷斯坦奶牛，在基础饲粮的基础上补充20 g/d瘤胃保护蛋氨酸，持续8周，分别在第0、8周的第7天采集瘤胃内容物。分析2个试验在不同时间点采集到的瘤胃内容物的细菌群落组成与多样性变化，以及功能稳定性差异。结果发现：2个试验中，瘤胃细菌的α多样性、β多样性、功能稳定性在不同时间点之间都不存在显著差异（P>0.05）。试验1在高丰度细菌的门和属水平上分别发现6个与1个差异细菌，分别是放线菌门、变形菌门、蓝菌门、绿弯菌门、互养菌门、纤维杆菌门与Lachnospiraceae＿NK3A20＿group；试验2在高丰度细菌的门和属水平上分别发现3个与1个差异细菌，分别为放线菌门、螺旋体门、迷踪菌门与unclassified＿f＿Lachnospiraceae。由此可见，在相同的饲粮条件下，泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃细菌组成随时间变化的程度有限，其多样性与功能稳定性均未发...     

不同亚种牛卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析

在体细胞核移植(克隆)试验中,作为受体细胞的卵母细胞是制约克隆效率的重要因素之一.本文通过对鲁西黄牛和荷斯坦奶牛进行活体取卵(OPU)试验,并以两个不同亚种的卵母细胞分别作为受体细胞进行奶牛体细胞克隆和胚胎移植试验,经卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析,探讨以鲁西黄牛代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体的可行性.结果显示,夏季鲁西黄牛OPU的效果更好,用鲁西黄牛卵母细胞构建的重构胚的融合率显著高于荷斯坦奶牛;鲁西黄牛卵母细胞形成的克隆胚移植后,其妊娠率、产犊率和活产率与荷斯坦奶牛相当;采用不同亚种克隆胚和不同类型受体牛互相组合进行胚胎移植,结果表明亚种内移植组妊娠率明显高于亚种间移植组,而且亚种内移植组非妊娠牛的返情时间也明显推后.以上结果说明,鲁西黄牛可以代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体和胚胎移植受体牛;不同亚种受体牛与克隆胚的适当组合可以显著提高胚胎移植的效果.本研究为以后开展不同亚种间克隆提供了可行性参考.     

荷斯坦奶牛采食量与养分转化率的研究

奶牛各类饲料有建议喂量.但奶牛对饲料养分的转化效率,还受奶牛的品种、日粮组成、饲养水平等因素影响.本次试验对330头荷斯坦泌乳牛实测.对此进行初步探讨.     

应用DGGE分析秸秆日粮对奶牛瘤胃细菌群落的影响

【目的】通过与苜蓿日粮比较,揭示秸秆日粮模式下瘤胃固液相细菌群落的独特结构。【方法】选择12头健康且体重相似的装有永久瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,分别饲喂以玉米秸秆（CS）和苜蓿、羊草、青贮玉米三者混合物（MF）为粗饲料组成的日粮,正饲期第13周连续3 d分12个时间点采集瘤胃固、液相内容物样品。提取微生物DNA后,利用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）分析细菌群落结构,并进行聚类分析及差异条带的测序分析。【结果】与MF组相比,CS组奶牛瘤胃固、液相细菌DGGE图谱条带的数目和光密度均有一定差异,两处理组都各有一些稍显优势的条带,CS组优势条带要少于MF组。与MF组相比,CS组液相细菌的香浓多样性指数无差异（P＞0.05）,固相细菌香浓多样性指数显著降低（P＜0.01）;通过对差异条带进行测序,发现与MF组相比,CS组中瘤胃细菌Prevotella sp.、Acetivibrio ethanolgignens和Clostridium sp.减少,并且大量来源于Bacteroidetes、Firmicutes、Tenericutes和Proteobacteria等菌门的未培养细菌有所变化。【结论】秸秆日粮条件下奶牛瘤胃存在独特的细菌群落结构,细菌多样性较低。     

中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析

为阐明中国荷斯坦奶牛和鲁西黄牛的线粒体DNA多态性及其起源关系.提取了2个品种牛外周血液中的线粒体DNA(mtDNA),用PCR方法将牛mtDNA全长分为4段进行扩增,并用NlaⅢ、HpaⅡ、BglⅡ等16种限制性内切酶进行酶解消化,分析2个品种牛mtDNA的多态性,最终经7种限制性内切酶片段长度多态性分析,共归纳出4种主要的单倍型.通过对2个品种牛mtDNAD环全序列的聚类分析表明:鲁西黄牛和中国荷斯坦奶牛可能均为混合母系起源,源于欧洲普通牛和印度瘤牛.该研究结果对提高动物体外受精和体细胞核移植效率等生物技术平台有一定的理论指导意义.     

利用实时定量PCR对瘤胃甲酸甲烷杆菌定量方法的建立与应用

 【目的】解决传统微生物评价方法存在的弊端，寻找快速、准确、灵敏的瘤胃微生物评价的新方法。【方法】利用实时定量PCR技术，以16S rDNA为靶序列，建立了瘤胃甲酸甲烷杆菌（Methanobacterium formicicum）的分子定量方法。【结果】采用本文所设计的引物、探针以及相应的PCR反应体系，检测极限可达到30拷贝（15个甲酸甲烷杆菌），与传统检测方法相比要更为迅速、灵敏。采用实时定量PCR技术所测得的细菌数量与采用传统的最大或然数记数法所测的细菌数量具有很高的相关性（r=0.957，P<0.01），表明采用实时定量PCR方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。利用所建立的方法对利鲁杂交肉牛和荷斯坦奶牛瘤胃液中甲酸甲烷杆菌进行了定量检测。结果表明，利鲁杂交肉牛瘤胃液中的甲酸甲烷杆菌浓度是荷斯坦奶牛的5.6倍。【结论】利用实时定量PCR技术建立的瘤胃甲酸甲烷杆菌的分子定量方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。     

秦川肉牛、荷斯坦牛及其杂交后代生长发育和产肉性能研究

【目的】分析比较秦川肉牛、荷斯坦牛及其杂交后代生长发育及产肉性能等经济性状。【方法】选择健康的6月龄秦川肉牛新品系公牛、阉牛、母牛(分别简称为秦川公牛、秦川阉牛、秦川母牛)、荷斯坦公牛、阉牛(分别简称为奶牛公牛、奶牛阉牛)和荷斯坦牛与秦川肉牛新品系杂交后代公牛、阉牛、母牛(分别简称为奶秦杂公牛、奶秦杂阉牛、奶秦杂母牛)各5头,共8组,进行18个月的标准化育肥,测定7~24月龄的体质量,每隔90d测定1次,计算平均日增质量;至24月龄屠宰实验牛并进行胴体分割,测定屠宰率、净肉率、胴体产肉率、肉骨比及各部位肉质量。【结果】各组试验牛在13~18月龄生长发育速度最快,荷斯坦牛生长发育速度较秦川肉牛和奶秦杂牛快。秦川肉牛的产肉性能明显优于荷斯坦牛,但与奶秦杂牛差异不显著。【结论】杂交改良牛既遗传了秦川肉牛优良肉质性能,也遗传了荷斯坦牛生长速度快的优点;秦川肉牛新品系已具备肉牛品种的基本特征;荷斯坦牛公犊经过育肥,也表现出良好的肉用性能。     

相似穿孔线虫伴生细菌群落多样性研究

[目的]揭示相似穿孔线虫伴生细菌群落物种丰度及其细菌多样性。[方法]通过构建细菌16S rDNA克隆文库,对阳性克隆进行ARDRA分析和构建系统发育树。[结果]依据97%序列相似性划分OTU,构建的细菌16S rDNA文库包含13个OTU,分别属于Alpha-proteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria,其中优势菌群为Betaproteobacteria,特别是Burkholderia为优势细菌。[结论]相似穿孔线虫的伴生细菌多样性较高,这些细菌可能对相似穿孔线虫具有一定的生态意义。     

牛亚科4个群体MHC-DRB3.2座位酶切多样性分析

采用限制性内切酶HaeⅢ、BstYⅠ分别对鲁西黄牛、渤海黑牛、盱眙水牛和中国荷斯坦奶牛MHC-DRB3.2基因的半巢式PCR产物进行酶切.结果表明:4个群体均在HaeⅢ酶切位点上表现多碱基突变,盱眙水牛等位基因数少于其他3个群体;鲁西黄牛、渤海黑牛和中国荷斯坦奶牛在BstYⅠ酶切位点上表现多碱基突变,而盱眙水牛未检测到突变;x2适合性检测表明鲁西黄牛、盱眙水牛2个群体在Hae Ⅲ酶切位点上碱基突变偏离Hardy-Weinberg平衡状态,中国荷斯坦奶牛在BstYⅠ酶切位点上碱基突变也偏离Hardr-Weinberg平衡状态,而鲁西黄牛和渤海黑牛在BstyⅠ酶切位点碱基突变已经或基本接近Hardy-Weinberg平衡;根据DA遗传距离和Roger遗传距离的NJ法和UPGMA法对4个群体进行亲缘关系聚类,鲁西黄牛和渤海黑牛首先聚为一类,其次是中国荷斯坦奶牛,盱眙水牛最后加入.结果显示:用牛的PCR-RFLP体系可进行水牛的MHC-DRB3.2基因的研究;盱眙水牛MHC-DRB3.2基因的突变率低于黄牛.     

品种选择对产奶量的影响

奶牛品种有乳用专用型,如荷斯坦牛(又称黑白花牛,见第24页图5)、娟姗牛(见第24页图6);有乳肉兼用型,如弗莱维赫牛(又称德国宝牛,见第24页图7)、西门塔尔牛、瑞士褐牛.从当前全世界奶牛饲养实际情况看,饲养比较多的有荷斯坦牛、娟姗牛、弗莱维赫牛、更赛牛、爱尔夏牛及瑞士褐牛等,其中荷斯坦牛占的比例最大,很多国家饲养数量占奶牛90％以上,目前,我国饲养的奶牛90％也是荷斯坦牛.根据牛的生产性能、适应性,这里介绍荷斯坦、娟姗和弗莱维赫3个品种.     

应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

 以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料, 经过DNA抽提和PCR扩增, 扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE，一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性。同时利用基因序列分析技术，分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列，并与现有的数据库进行了比较。结果表明，饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%)；饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成，DGGE谱带变化程度分别为1号36%、2号46%、3号30%。基因序列分析表明，DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%，8个基因序列的相似性在90%～96%，余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中，只有1个被鉴定为Prevotella sp.，其余4个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。     

用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响

选取装置永久性瘤胃瘘管的中国美利奴绵羊,采用5×5拉丁方试验设计,在绵羊日粮中分别添加5或10 g/d Tween 20,3或6 g/d Tween 80,以空白为对照,采用PCR-DGGE技术研究不同水平的非离子表面活性剂Tween 20和Tween 80对绵羊瘤胃中细菌多样性的影响;对DGGE指纹图谱中的12个优势DNA条带的16S rDNA进行测序和序列分析,在线寻找其相似的细菌分类。结果显示,5个组之间DGGE指纹图谱的相似性在65.4%～75.4%。与对照组相比,除10 g/d吐温20组外,其他各组的细菌丰度均有不同程度的下降。DNA序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA序列中有8个条带序列与GenBank中已知序列的相似性大于97%。受吐温20影响的细菌与Microbacteriumoxydans、Schlegelella aquatica、Brevundi monas sp.、Lachnospir-aceae和Methylobacillus sp.有较高的相似性;而受吐温80影响的细菌与Schlegelella aquatica、Acinetobacter soli和Microbacteriumoxydans有较高的相似性。日粮中添加吐温20和吐温80后,高剂量的吐温20使绵羊瘤胃中的优势菌种类增加,吐温80和低剂量的吐温20使优势菌种类下降。在绵羊瘤胃细菌中,受吐温20和吐温80影响的种类不同。     

不同栽培环境下有机与常规蔬菜土壤的细菌群落多样性差异

土壤细菌群落在蔬菜栽培中发挥着重要作用.基于DNA和RNA水平,利用PCR-DGGE技术研究了不同栽培环境下有机与常规蔬菜土壤细菌群落多样性差异,以及土壤理化性质与细菌群落多样性的关系.结果表明:不同栽培方式下土壤细菌多样性存在明显差异,土壤微生物的优势种群和数量受有机、常规栽培和季节影响,有机栽培较之常规栽培能够显著增加土壤细菌群落多样性;聚类分析表明,16S rDNA细菌群落多样性与季节相关,而16S rRNA细菌群落多样性与栽培方式相关;差异条带测序显示,大多细菌与不可培养细菌种属有较高同源性,其余9种推测属于假单胞菌属;CCA分析说明pH是影响土壤细菌群落多样性的主要因素,有机栽培土壤中微生物生物量C、N以及有机质含量显著高于常规栽培土壤.综上,有机栽培能够丰富活性细菌群落多样性,具有土壤优化效应.     

过量施肥下氮素形态对旱地土壤细菌多样性的影响

采用细菌16SrDNA的PCR-RFLP技术,以西北地区土垫旱耕人为土为材料,模拟田间过量施肥水平,经室内恒温短期培养,研究了过量施肥下酰胺态氮、硝态氮和铵态氮对土壤细菌多样性的影响。结果显示:PCR-RFLP分析酰胺态氮(T1)、硝态氮(T2)和铵态氮(T3)过量施肥处理的细菌16SrDNA克隆文库,分别得到17、25和130个酶切分型,不施肥对照(CK1)和正常施肥对照(CK2)分别得到119和187个酶切分型,表明正常施肥处理的酶切分型最多,过量使用酰胺态氮和硝态氮减少了酶切类型,而过量施用铵态氮可以维持与不施肥对照相近的酶切类型数量。采用α多样性测度对试验结果进行分析统计表明,不同处理间土壤细菌的多样性指数(H'、Ds)和物种丰富度指数(dM)a均为CK2>T3>CK1>T2>T1处理,表明合理施肥可显著增加土壤中细菌的多样性,而过量施用酰胺态氮则减少细菌的多样性,使用铵态氮处理可维持细菌多样性;除正常施肥对照(CK2)外,其余各处理都出现了优势菌种。通过对优势菌的16SrDNA序列比对发现,酰胺态氮处理都为未培养细菌,硝态氮处理和铵态氮处理的优势菌呈现了菌属多样性,前者包括变形菌门的假单胞菌属和寡养...     

广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析

【目的】对柑橘健康植株和感染黄龙病植株的韧皮部内生细菌的多样性进行比较分析,为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。【方法】采用常规分离培养与分子鉴定的方法和基于16S rDNA基因的限制性酶切长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析的方法。【结果】用常规分离与分子鉴定方法获得10个属细菌类群,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)为无症健株的优势菌群;微杆菌属(Microbacterium sp.)、芽孢杆菌属、假单胞菌属和考克氏菌属.为黄龙病罹病植株的优势菌群。PCR-RFLP方法得到29种酶切图谱,共鉴定出10属可培养细菌以及11种不可培养细菌。健株与病株中Dyella sp.、Pseudomonas sp.、Serratia sp.和未培养细菌所占比例均大于5%。柑橘健株与病株中细菌的种群密度和菌群种类存在明显差异。【结论】研究结果表明柑橘健株和病株韧皮部组织中的内生细菌优势菌群存在明显差异,而伴生细菌的优势菌群与黄龙病菌的相互关系正在深入分析研究。     

16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及菌群结构

【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法(珠磨法、反复冻融法)、化学法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法,组合生成9种不同方法,即方法 1(CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 2(CTAB+SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 3(CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法)、方法 4(CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 5(CTAB+Lysozyme+反复冻融法)、方法 6(CTAB+Lysozyme+珠磨法)、方法 7(SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 8(SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 9(SDS+Lysozyme+珠磨法),同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit(方法 10)为对照,以这10种方法来提取瘤胃微生物基因组DNA,并通过DNA浓度、纯度、DNA电泳图等基本性质及16S r RNA高通量测序结果对其进行分析比较,同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结果】不同DNA提取方法效率比对结果显示,同样的化学及生物酶裂解条件下,结合珠磨法及反复冻融法能够显著地增强细胞裂解效率,提高DNA产量。其中方法 3及方法 6提取的DNA具有较高的浓度及纯度,方法 7—10缺乏CTAB阳离子去污剂,提取的DNA量显著低于其他方法(P0.05),除方法 2和8所提取的样品经多次试验,PCR产物目的条带太弱或未检测到外,其余8种方法提取的样品PCR产物目的条带大小正确,浓度合适,符合高通量测序的要求。16S r RNA高通量测序共生成了191 349条原始数据,质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分析表明,数据量合理并达到饱和,能够完整反映样品的菌群种类。OTU聚类数据统计、分类学和多样性指数分析显示方法 6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法 6裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上,方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨)提取的DNA产量、样品多样性指数及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括21门、35纲、75科、112属,丰度较高的菌群依次是拟杆菌Bacteroidtes(64%)、厚壁菌Firmicutes(20%)、螺旋体Spirochaetae(2.3%)和变形菌Proteobacteri(1.8%),纤维杆菌Fibrobacter(1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存在着一定的差异,这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用16S r RNA高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基因组DNA理想提取方法,即方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨),并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构,为研究牦牛瘤胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。     

徐淮白山羊瘤胃细菌和原虫的类群结构研究

 【目的】研究以稻草为主的日粮条件下徐淮白山羊瘤胃细菌和原虫的类群结构。【方法】以4只安装瘤胃瘘管的徐淮山羊为试验动物,PCR扩增瘤胃细菌16S rDNA序列,利用分子克隆与测序分析、细胞计数等技术,解析瘤胃细菌和原虫群体的类群组成。【结果】获得的细菌克隆基本归为两簇：与瘤胃球菌R.bromii YE282相似性为95%的XHGR1、与瘤胃R-7菌相似性为98%的XHGR3,XHGR2位于另立的R. flavefaciens簇。瘤胃球菌属细菌占细菌克隆总数的比例较高（33.33%）,原虫生物量略低于细菌,占瘤胃生物总量的44.83%。群体主要有内毛属、双毛亚科、前毛属、头毛属和等毛科等原虫,其中内毛属原虫比例最高为74.25%。【结论】以稻草为主的日粮条件下,徐淮白山羊瘤胃中细菌和原虫生物量相近,瘤胃球菌属细菌和内毛属原虫分别是瘤胃细菌和原虫区系的优势类群。     

福建三沙湾养殖大黄鱼肠道菌群研究

为研究大黄鱼（Pseudosciaena crocea）肠道细菌的群落结构,提取大黄鱼肠道内容物和肠壁样品总DNA,构建细菌16SrDNA克隆文库．分别从两个文库中随机挑选阳性克隆子测序,序列同源性分析和系统进化分析结果表明：在大黄鱼肠道中存在梭杆菌纲（Fusobacteria）细菌、拟杆菌纲细菌（Bacteroidetes）和γ-变形细菌纲（γ-Proteobacteria）细菌．肠壁样品细菌多样性高于肠道内容物样品．梭杆菌属细菌在肠道内容物样品中占据优势地位,而肠壁样品则以拟杆菌属细菌为最优势细菌类群,其次是梭杆菌属细菌。两个样品中均只检测到少量γ-变形细菌纲细菌．     

红曲黄酒传统酿造过程中的细菌菌群结构及其动态变化

采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、克隆文库技术和限制酶切片段长度多态性(RFLP)等相结合的方法,探究了红曲黄酒传统酿造过程中的细菌菌群结构及其动态变化。变性梯度凝胶电泳(DGGE)试验结果表明,在传统酿造过程中的初期阶段的优势菌株包括植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus和短乳杆菌Lactobacillus brevis,随着酿造时间的增加,植物乳杆菌将逐渐占据绝对优势;利用限制酶切片段长度多态性(RFLP)技术对16SrDNA文库中的克隆子进行酶切分型,共得到19种RFLP图谱类型,测序鉴定结果与变性梯度凝胶电泳(DGGE)结果相似,但16SrDNA克隆文库分析检测到了戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus,该菌未见于变性梯度凝胶电泳(DGGE)结果中。变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、克隆文库技术和限制酶切片段长度多态性(RFLP)等多种方法相结合,有助于更为全面、客观地研究红曲黄酒传统酿造体系中的细菌群落结构及多样性。