甘薯zds基因的克隆与植物表达载体构建

β-胡萝卜素是维生素A原,对人体健康具有重要作用,可降低多种癌症特别是肺癌的发病率.ζ-胡萝卜素脱氢酶是β-胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一.根据其它植物ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(zds)的保守序列,设计简并引物,从甘薯块根总RNA逆转录的cDNA中扩增出608 bp的zds保守序列,然后用RACE技术扩增出该基因的全长cDNA.zds全长cDNA共2057 bp,有一1773 bp的开放阅读框,编码591个氨基酸,相对分子质量为65 ku.并成功构建了zds植物表达载体p2300-zds,可进一步用于提高作物β-胡萝卜素含量的遗传转化研究.     

辣椒ACC氧化酶基因部分序列的分离与鉴定

乙烯作为一种植物激素，在植物生长发育过程中发挥着重要的作用。1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途径中的一种关键酶。本研究以辣椒为研究材料，根据报道的辣椒ACC氧化酶基因序列（AJ011109）设计引物，利用PCR的方法从中国种湘研4号基因组获得长度为354bp的gDNA序列和213bp的cDNA序列。利用生物信息学软件对所获得的gDNA和eDNA序列进行了分析。     

八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析

类黄酮是植物体内一类重要的次生代谢产物,对植物的生长发育有着重要的调节作用。查尔酮合成酶是植物类黄酮合成途径的第一个关键酶,在调控类黄酮的生物合成中起着决定作用。本研究采用RTPCR方法扩增得到一条菘蓝查尔酮合成酶家族蛋白基因,命名为IiCHS,全长1 273 bp,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分析其编码的蛋白质序列显示其属于查尔酮合成酶家族蛋白,定位于胞质中。该研究不仅有助于分析查尔酮合酶基因的功能,而且还为进一步利用该基因资源改良菘蓝品质奠定了理论基础。     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1099bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋（alpha helix）,占46.72%;53个延伸链（extended strand）,占14.48%;27个β折叠（beta turn）,占7.38%;115个无规则蜷曲（random coil）,占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

柚cDNA中NBS-LRR类R基因同源序列的分离

 提取柚花柱的总RNA，通过逆转录合成其cDNA，根据已知植物抗病基因（R基因）的NBS保守区设计简并引物，对cDNA进行扩增，获得大小约为500 bp的PCR产物，对连接产物进行酶切归类，筛选得到不同类别的克隆12个，并进行了测序。通过序列同源比较分析发现，其中有10个片段属于NBS-LRR类抗病基因的同源序列（RGA），与已知植物R基因相应区段的氨基酸序列的同源性为11.5%～47.1%。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

含羞草叶片转录组测序及其黄酮合成途径解析

为了解析含羞草中黄酮类物质的生物合成途径，利用Illumina platform 2000^TM测序平台对含羞草叶片进行转录组测序，共获得94 182个Unigene，平均长度为695 bp，N₅₀值为1 159 bp。共有30 243个Unigene注释于50个GO功能组中，其中“代谢过程”“催化活性”以及“细胞”注释的Unigene数量较多。KEGG通路分析鉴定出49个Unigene注释在黄酮生物合成途径，分别编码查尔酮合成酶（CHS,12个Unigene）、查尔酮异构酶（CHI,4）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H,3）、黄烷酮-3’-羟化酶（F3’H,9）、黄烷酮-3’,5’-羟化酶（F3’,5’H,1）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR,5）、黄酮醇合成酶（FLS,3）以及无色花色素还原酶（LAR,12）基因。从转录组数据库中鉴定出7 382个以单核苷酸和三核苷酸为主要类型的SSR标记。随机选出10对SSR引物进行扩增，其中有7对能够扩增出清晰的条带。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

刺梨两个缩合单宁合成基因的克隆与分析

为克隆获得刺梨中调控单宁合成的相关基因,以贵农5号刺梨为材料,根据GeneBank中登录的基因序列设计引物,采用RT-PCR的方法从刺梨果实中克隆获得了参与高等植物单宁合成的2个基因ANR和LAR的cDNA片段,分别长712bp和408bp,编码237个和135个氨基酸。序列分析表明,ANR和LAR的cDNA序列推导的氨基酸序列与GeneBank中登录的其他植物来源的基因相似性均达100%。     

油果实中查尔酮合成酶基因PsCHS的克隆表达分析及其启动子的分离

从成熟果实均一化全长cDNA文库中分离了编码CHS基因的全长cDNA序列,命名为PsCHS,根据其序列设计引物,采用Genome Walking方法从基因组DNA中分离获得PsCHS基因上游的调控序列,命名为PsCHSp,PsCHS基因全长1 442bp,其中ORF 1 176bp,编码392个氨基酸;采用APA-Walking技术,获得该基因的5ˊ端调控区,经在线软件预测,启动子序列含有典型的结构特征元件TATA-box和CAAT-box,还包含光响应元件、厌氧诱导元件、胚乳表达相关元件、MYB结合位点以及激素响应元件;RT-PCR结果显示,PsCHS基因在果实发育的前期表达量较高,花后40d表达量最高,随后开始下降,果实成熟期表达量较低。分离获得的PsCHS基因属于查尔酮合成酶基因家族成员之一,查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)是类黄酮合成途径中的一个重要酶,该基因可能对类黄酮的合成起到调控作用。     

枸杞胆碱合成关键酶基因PEAMT的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR和RACE结合的方法,获得了枸杞磷酸乙醇胺N-甲基转移酶PEAMT基因cDNA全序列(命名为LbPEAMT).LbPEAMT cDNA全长1 863 bp,开放读码框1 497 bp,编码一个由498个氨基酸构成的多肽,理论分子量为56.53 kDa,等电点pⅠ为5.50.通过多种序列比对,该基因编码的氨基酸序列与番茄PEAMT氨基酸的相似性为93％.二级结构预测LbPEAMT蛋白由44.98％的α-螺旋、17.67％的延伸链、6.63％的β-转角和30.72％的不规则卷曲组成.LbPEAMT是一个亲水蛋白.含有2个S-腺苷甲硫氨酸依赖催化活性结构域,分别位于N端65-164 aa和C端290-392aa.每个活性区都包含有4个部分基序,分别为Ⅰ、post Ⅰ、post Ⅱ和post Ⅲ.LbPEAMT的这2个活性区在蛋白、磷脂和小分子甲基转移酶中都是相对保守的.     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

番茄果实ABA合成酶NCED基因的克隆及其RNAi遗传转化体系的建立

以番茄为材料,根据ABA合成关键酶编码基因NCED的保守序列设计引物,通过RT-PCR方法从番茄果实中克隆了2个NCED基因片段,Le NCED1和Le NCED2。通过农杆菌介导法进一步建立了‘嘉宝’番茄Le NCED1基因的RNAi再生和转化体系,并研究影响番茄遗传转化的4个因素外植体类型、预培养时间、激素组合、农杆菌侵染时间。结果表明:番茄子叶预培养2 d,用农杆菌LBA4404侵染5 min后,避光共培养2 d,在加入1mg/L 6-BA+0.05 mg/LIAA+5 mg/L潮霉素的MS培养基上可以诱导出芽,转入添加0.1 mg/LIAA+7 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上可以使芽生根。本实验共获得26株抗性植株。GUS染色证明,有9株抗性植株成功转入含有NCED基因RNAi载体的T-DNA,为深入了解ABA促进番茄果实成熟的机理提供了方法和材料。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

植物花青素生物合成转录调控研究进展

花青素是高等植物中发现的一种次生代谢物,能够决定花和果实的颜色,保护植物免受各种生物和非生物胁迫损伤。花青素生物合成由一系列结构基因编码的酶催化完成,属于类黄酮途径一个特异分支,其合成结构基因的表达受由MYB、bHLH和WD40 3类转录因子组成的MBW（MYB-bHLH-WD40）转录复合体协同调控。文章主要就MYB、bHLH和WD40 3类转录因子在调节结构基因表达和花青素合成中的功能和作用进行综述。     

擎天凤梨苞片叶绿素代谢关键基因的分离及褪绿的分子机理

【目的】擎天凤梨是一种新潮花卉,其苞片在成花变色过程中常常伴随着绿色的逐渐消退。分离叶绿素生物合成与降解途径的关键基因,探索在苞片变色过程中叶绿素代谢的分子基础和机理,有助于解析呈色苞片中绿色退化的原因。【方法】通过cDNA文库构建及EST批量测序获得叶绿素合成关键酶：谷氨酰tRNA合成酶基因（glutamyl-tRNA synthetase,GTS）和尿卟啉原-Ⅲ合酶基因（uroporphyrinogen-Ⅲsynthase,UROS）;通过同源克隆技术获得叶绿素降解关键酶：脱镁叶绿素酶（pheophytin pheophorbide hydrolase/pheophytinase,PPH）基因;通过采用透光系数法测量叶绿素含量、HPLC法测定类黄酮含量以及采用实时定量PCR法测定叶绿素代谢关键基因的基因表达模式,探索呈色苞片中绿色部分消失的分子机理。【结果】获得的GTS（GenBank：KP144289）,序列长为1 140 bp,编译171AA的蛋白氨基酸序列,并存在GlnRS-cataytic core 和Nt-trans superfamily保守区;获得的UROS（GenBank：KP144288）cDNA序列长为613 bp,编译188AA的蛋白氨基酸序列,并存在HemD和HemD Superfamily保守区;获得的PPH（GenBank：KP723523）cDNA序列长为266 bp,编译88AA的蛋白氨基酸序列,并存在Abhydrolase-6保守区。通过对不同变色阶段苞片的叶绿素、类黄酮含量测定以及叶绿素代谢相关基因的表达水平分析,可知苞片变色过程伴随着叶绿素含量的显著降低和类黄酮含量的明显增加,同时叶绿素合成相关的GTS和UROS表达水平也明显降低,而叶绿素降解关键酶基因PPH的表达水平在苞片变色初期显著上升,在变色完成后则降低到接近绿叶状态的最低水平。而作为对照材料的绿叶,其叶绿素含量是最高的,而类黄酮含量是最低的,同时叶绿素的合成相关酶基因表达量最高,而降解相关酶基因表达量最低,这与彩叶植物中叶绿素和类黄酮色素的表现较为一致。【结论】获得了擎天凤梨的叶绿素合成相关酶基因GTS和UROS以及降解关键酶基因PPH。由于叶绿素合成量减少,降解量显著增加引起叶绿素含量的降低,从而影响苞片变色过程中绿色的消退,并伴随类黄酮含量的增加。PPH在叶绿素的降解过程中起关键性作用。     

番茄一个褪黑素合成基因的cDNA克隆与表达分析

为深入研究褪黑素的分子生物学功能,根据番茄基因组数据库的SlSNAT基因序列信息设计引物,以耐盐番茄材LA1401(PI365967)叶片RNA反转录得到的cDNA为模板,利用高保真酶克隆了番茄的褪黑素合成酶基因SlSNAT,基因CDS(coding sequence)序列全长为768 bp,共编码255个氨基酸。利用酶切连接的方法,构建了该基因的超表达载体。实时定量PCR结果表明,SlSNAT基因在叶片中的表达量最高,显著高于其在花、果实、根、种子和萼片中的表达量。在不同非生物逆境处理下的表达结果显示,在干旱处理条件下的表达量最高,其次是在甘露醇的渗透胁迫逆境,在这2种胁迫条件下的表达量均显著高于其在过氧化氢、氯化钠、低温和褪黑素诱导下的表达量。另外,在盐胁迫条件下,SlSNAT基因在根部的表达量受到明显抑制。