基于PTN系统分析不同种植地转基因水稻种子可培养内生真菌菌群的多样性

【目的】比较不同种植地、不同品种来源的转基因(genetically modified,GM)水稻近等基因系种子内生真菌的丰富度和多样性,探讨变异发生的影响因素,为研究GM水稻种子内生真菌种群结构的非预期变异提供科学基础。【方法】收集转2mG2-epsps抗草甘膦水稻株系(transgenic line,T),及相应的对照样本亲本品种(parent variety,P)和非转基因组培再生株系(non-transgenic regeneration line from tissue culture,NR),建立亲本对照-转基因株系-非转基因对照(parent control-transgenic plant line-non-transgenic control,PTN)近等基因系。粳稻品种日本晴亲本(P1)及其相应的T16和NR25组成P1近等基因系(P1 near-isogenic line,P1L),粳稻品种PJ574亲本(P2)及其相应的T23和NR18组成P2近等基因系(P2 near-isogenic line,P2L)。在海南省(Hainan province,H)和浙江省富阳市(Fuyang,Zhejiang province,F)两地种植并收获水稻种子,采用组织培养法分离内生真菌,通过形态学和分子生物学相结合的方法对菌株分类鉴定。以分离率(isolation rate,IR)、分离频率(isolation frequency,IF)、丰富度指数Margalef(D)、多样性指数Shannon-Wiener(H')和均匀度指数Evenness(E)反映真菌的结构和分布,以Sorenson相似性系数(Cs)和Fisher精确检验(Fisher's exact test)结果描述水稻样本之间的内生真菌菌群组成差异。【结果】从海南省和浙江省富阳市两地的P1L和P2L近等基因系水稻种子样本中共分离121株内生真菌,鉴定为15个属,其中,Curvularia、Dendryphiella、Epicoccum、Fusarium为优势菌属,Fusarium为两地共有的优势菌属。F地水稻种子内生真菌总IR(4.61%)是H地样本(0.83%)的5.05倍。F地样本内生真菌类群的丰富度指数(2.29),Shannon-Wiener(H')多样性指数(1.63)和均匀度指数(0.66)均显著高于H地样本。H地种植的P1L和P2L种子内生真菌菌属组成的相似性系数(Cs)为0.615,F地种植时二者的Cs=0.737,均为中等相似,Fisher精确检验分析表明二者无显著性差异(P0.05)。除HT16外的GM株系与相应亲本种子内生真菌类群的相似性系数为0.500—0.667,均为中等相似。但与相应亲本相比,GM水稻株系种子内生真菌的IF和菌属数存在显著性非预期变异,其中IF变异方向和幅度因种植地不同而波动。而且FT16增加2个菌属Phaeosphaeria和Nigrospora,HT23增加了1个菌属Letendraea helminthicola,FT23增加了Curvularia和Cladosporium 2个菌属,这些GM株系种子内生真菌菌属增多的变异来源于转基因插入突变,需要关注其安全性。而GM株系种子内生真菌种类减少的变异来源于组织培养无性系变异,较为安全。水稻种子真菌IF变异幅度及排序:P1和P2品种两地之间差异(30.58%)P1和P2品种之间差异(27.28%)NR株系变异(23.14%)GM株系变异(22.32%)。种子内生真菌总属数变异幅度及排序:P1和P2品种两种植地之间差异(9)P1和P2品种之间差异(8)=NR株系变异(8)=GM株系变异(8)。【结论】水稻种子内生真菌丰富多样,可培养内生真菌绝大多数为子囊菌。不同种植地域水稻种子内生真菌菌群组成存在差异,镰刀菌(Fusarium)为海南省和浙江省富阳市两地水稻种子的共有优势内生菌属。转基因技术和组织培养技术均显著影响水稻种子内生真菌类群的结构,但其非预期变异效应低于种植地域影响和品种差异,其中GM水稻种子内生真菌菌属种类增多的变异主要来源于转基因插入突变效应,需安全性评估。     

利用PTN系统快速解析转基因水稻种子可溶性蛋白非预期变异的来源

【目的】建立转基因（genetically modified,GM)水稻安全性评价的亲本对照-转基因株系-非转基因对照（parent control-transgenic plant-nontransgenic control,PTN)系统。通过实质等同性比对分析,追溯GM水稻种子蛋白质非预期变异的技术根源,为GM水稻的安全性评价提供技术支持。【方法】根据GM水稻植株培育的技术原理,收集转基因株系（transgenic line,T）、亲本品种（parent variety,P）及其他遗传学背景相关的非转基因组培再生株系（non-transgenic regeneration line from tissue culture,NR）和非转基因遗传分离阴性后代株系（non-transgenic segregated negative offspring line,NS）等对照样本。以转2mG2-epsps抗草甘膦GM水稻株系T13和T23及各自的PTN系统对照样本（P、NR和NS）为试验材料,以种子蛋白质含量和组分的非预期变异为研究对象,根据PTN样本间的多重比较结果解析并追溯GM水稻非预期变异的技术根源。水稻种子可溶性蛋白的提取采用分级提取法,依次用蒸馏水、5% NaCl、70%乙醇和0.1 mol·L-1 NaOH提取稻米清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。蛋白含量测定应用Bradford法,蛋白组分分析采用SDS-PAGE电泳法。【结果】GM水稻株系T13和T23种子总可溶性蛋白含量分别比亲本显著降低3.29%和6.84%,主要受谷蛋白变异影响,但GM水稻变异的最大幅度小于天然水稻亲本P1和P2品种间差异,说明GM水稻种子可溶性蛋白含量变异在安全范围之内。与各自亲本相比,GM水稻株系种子清蛋白和醇溶蛋白组分差异不显著,球蛋白和谷蛋白个别组分存在显著或极显著变异,主要表现为含量的增减。T13株系的56 kD和24 kD球蛋白含量比亲本P1显著增加,T23的65 kD球蛋白含量比亲本P2极显著降低。GM株系T13和T23的谷蛋白组分变异趋势相似,与相应亲本相比,主要表现为19-23 kD和33-38 kD谷蛋白含量显著增加,100 kD和9 kD谷蛋白含量显著减少。突出的变异是GM水稻新增加了41 kD和56 kD谷蛋白组分,但这些变异新组分也同样存在于NR和NS对照样本中。GM水稻株系T13和T23的可溶性蛋白非预期变异的特征与相应的NR对照样本基本一致。NS23对照株系的清蛋白含量和球蛋白组分存在不同于T23和NR23的独特非预期变异。【结论】GM水稻种子总可溶性蛋白质变异主要受谷蛋白含量变异影响,变异幅度小于天然水稻品种间差异。GM水稻种子的清蛋白、醇溶蛋白组分未发生显著变异,球蛋白和谷蛋白个别组分发生了显著变异。GM水稻种子蛋白质非预期变异主要来源于组织培养无性系变异,转基因插入突变的影响较小。     

不同品种南瓜内生细菌多样性及PICRUSt基因功能预测分析

【目的】比较5个不同品种南瓜内生细菌多样性特征并开展基因功能预测分析,为挖掘和利用南瓜内生细菌功能菌株及开拓南瓜辅助育种新方向提供理论依据与参考。【方法】采集5个不同品种南瓜茎部,基于MiSeq高通量测序技术比较分析南瓜茎内生细菌多样性与丰富度,内生细菌门、属分类水平的群落结构组成,以及不同品种南瓜茎内生细菌优势菌群占比。【结果】不同品种南瓜茎部内生细菌多样性与丰富度指数均无显著差异。5个品种南瓜茎内生细菌群落结构由18个门,30个纲,101个目,199个科,362个属,567个种和863个OTU组成,但不同品种南瓜茎中的内生细菌分类阶层总数存在差异。门分类水平,变形菌门（Proteobacteria）细菌是不同品种南瓜茎部的主要优势细菌门类,不同南瓜品种内生细菌群落结构组成相似,但丰度占比不同;属分类水平,假单胞菌属（Pseudomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、剑菌属（Ensifer）、德沃斯氏菌属（Devosia）细菌是不同品种南瓜茎部的主要优势细菌属,优势内生细菌属组成及其丰度随南瓜品种的不同呈现明显差异。杂交品种与父母本品种的门、属分类水平优势内生菌组成及占比均基本相同。PICRUSt分析显示,不同品种南瓜茎部内生细菌主要涉及6个生物代谢通路及46个子功能。不同品种南瓜茎部内生细菌基因二级功能层预测基因种类基本无差异,但基因拷贝数却随着品种不同而异。环境条件是影响南瓜植株内生细菌多样性和丰富度的重要因素;不同品质南瓜植株具有相异的内生细菌群落结构,品质优良南瓜品种具有富集内生细菌的趋势;假单胞菌属（Pseudomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、剑菌属（Ensifer）、德沃斯氏菌属（Devosia）等13个菌属是5个不同品种南瓜茎部的共有优势内生细菌属;而糖霉菌属（Glycomyces）、Candidatus_Rubidus属和Actinokineospora属细菌是品质最优品种——‘桂丰7号’香芋南瓜茎部特有的优势内生细菌属;同时,‘桂丰7号’香芋南瓜茎部内生细菌基因功能中,涉及碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢等37个二级功能层预测基因拷贝数在5个南瓜品种中数量最多。【结论】特有的优势内生细菌属和更为丰富的二级功能预测基因拷贝数均是‘桂丰7号’香芋南瓜品质优于其余4个品种南瓜的重要原因,糖霉菌属（Glycomyces）、Candidatus_Rubidus属和Actinokineospora属细菌有望作为提高南瓜品质的备选功能内生细菌属。     

滇西槽舌兰内生真菌多样性及其共生真菌对叠鞘石斛种子萌发的效应

兰科植物种子萌发甚至整个生长阶段依赖于共生真菌。滇西槽舌兰（Holcoglossum rupestre）是我国特有极度濒危物种，为了更好地开展其种质资源保护，采集云南香格里拉、楚雄、昆明盘龙、昆明呈贡的滇西槽舌兰植株，基于ITS rDNA序列对其根部的内生真菌进行分离、鉴定和多样性分析，并研究这些内生真菌对叠鞘石斛（Dendrobium denneanum）种子萌发的影响。结果表明，滇西槽舌兰4个分布地植株的根内共分离、鉴定出68株内生真菌，分别属于粪壳菌纲（Sordriomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）和座囊菌纲（Dothideomycetes）3个纲18个属。其中，镰刀菌属（Fusarium）、间座壳属（Diaporthe）、胶膜菌属（Tulasnella）、角担菌属（Ceratobasidium）的相对丰度分别为27.94%、10.29%、8.82%、8.82%，为主要优势内生真菌。胶膜菌属和角担菌属为滇西槽舌兰首次分离到的兰科共生菌，且胶膜菌属的P2和P47菌株可以显著促进叠鞘石斛种子萌发进程及萌发一致性。     

油茶根际土壤真菌群落组成及多样性分析

为明确贵州油茶（Camellia oleifera Abel.）根际土壤真菌组成及多样性,同时探究其根际土壤真菌与土壤环境因子的相关性,以来自贵州贵阳、天柱、玉屏、望谟、威宁、黎平和册亨共7个地区的油茶根际土壤微生物为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术对真菌群落的组成结构进行分析,同时测定其土壤理化性质,并与根际土壤真菌群落进行相关性分析。结果表明,油茶根际土壤呈酸性,富含有机质和速效钾,但少氮低磷,且不同地区土壤理化性质差异显著。Alpha多样性分析表明,油茶根际土壤真菌具有丰富的多样性,其中,望谟地区多样性最高;册亨次之;而贵阳最低。Beta多样性分析则显示7个地区间油茶根际土壤真菌组成具有显著差异。7个地区土壤样品中共获得634个OTUs（operational taxonomic units）,隶属于9门、32纲、73目、141科和213属。在门水平,玉屏地区根际土壤真菌的优势菌门为担子菌门（Basidiomycota）,其余6个地区根际土壤真菌的优势菌门均为子囊菌门（Ascomycota）。在属水平,沙蜥属（Saitozyma）、Archaeorhizomyces、被孢霉属（Mortierella）等在不同地区间的分布与相对丰度存在显著差异。相关分析表明,土壤全钾、有效磷、速效钾和有机质含量是影响油茶根际土壤真菌群落组成的主要驱动因子。其中,青霉属（Penicillium）、Cladophialophora、Oidiodendron等部分土壤真菌与土壤环境因子呈显著正相关性;而具有致病特性的Ilyonectria和镰刀菌属（Fusarium）与土壤环境因子呈显著负相关。以上研究结果为开发有益的油茶根际真菌资源,以及通过调控土壤环境因子来预防油茶病害提供了科学依据。     

不同处理对连作障碍土壤真菌群落结构的影响

连作障碍引起种植作物产量及品质下降,严重制约着当前农业的可持续发展。本文采用ITS扩增子测序研究厌氧还原、覆膜增温、熏蒸剂和消毒剂4种处理对连作土壤中真菌群落多样性及结构的影响,同时也探究了对病原菌的影响。结果显示,覆膜增温显著增加真菌群落的多样性,棉隆熏蒸剂使其丰富度指数显著性降低。在门水平上,主要优势菌门有Ascomycota、Chytridiomycota和Mortierellomycota,覆膜增温与消毒剂处理分别显著降低和增加Ascomycota的相对丰度;在属水平上,共检测出378种菌属,覆膜处理后优势菌属Chaetomium的相对丰度显著性降低。共检测出4种致病菌Fusarium、Alternaria、Verticillium和Botrytis,其中厌氧还原组T1对Top 1菌属Fusarium抑制效果最强,抑制率为88.47%。研究结果为连作障碍土壤的治理和防护技术的研究奠定了理论基础。     

不同抗性小麦品种叶部真菌区系分析

对抗、感叶枯病小麦品种不同生育时期叶部的附生和内生真菌区系进行了系统分析．结果表明,每个品种都有自己独特的叶部真菌区系,抗病和感病品种叶部附生真菌区系差异不大,但内生真菌区系组成则有明显不同,一般感病品种内生真菌种类多于抗病品种．研究结果还发现,小麦内生真菌种数明显多于附生真菌．小麦叶部内生真菌优势属主要为链格孢属（Alternaria spp．）、青霉属（Penicillum spp．）和曲霉属（Aspergillus spp．）;附生真菌优势属多为木霉属（Trichoderma spp．）和镰刀菌属（Fusarium spp．）．生育时期对小麦叶部真菌区系组成具有较大影响,随生育时期延长,叶部附生和内生的真菌种类也不断增多．     

小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落结构研究

为了解小豆和绿豆茎基感病部位的真菌组成,采用Illumina高通量测序对小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落结构进行分析。结果表明,小豆和绿豆6个茎基感病部位真菌群落样品测序优化后共得到231个OTU （operational taxonomic units）,共同OTU为97个。2种作物茎基感病部位真菌群落中共同的优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）,优势菌纲为粪壳菌纲（Sordariomycetes）,优势菌目为肉座菌目（Hypocreales）,优势菌科为从赤壳科（Nectriaceae）。对优势菌属分析发现,小豆和绿豆茎基感病部位镰刀菌属（Fusarium）处于绝对优势,相对丰度分别为32.94%和18.38%。Alpha多样性指数结果表明,绿豆茎基感病部位的真菌群落丰度高于小豆茎基感病部位的真菌群落丰度,但二者真菌群落多样性相似,为进一步研究小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落的致病机理提供了理论依据。     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

淹水对辣椒连作土壤化学性质与微生物群落结构的影响

【目的】 明确淹水对连作辣椒土壤环境的影响,为减轻辣椒连作障碍提供技术依据。【方法】 以安徽和县的大棚内连作辣椒进行连续3年的淹水和不淹水土壤为研究对象,以不淹水为对照,采用流动分析仪、qPCR荧光定量技术和Miseq测序技术探究淹水对辣椒连作土壤化学性质和微生物群落结构的影响;同时以辣椒为试材,采用体外培养皿法验证淹水和不淹水土壤对辣椒种子萌发和幼苗生长的影响。【结果】 土壤淹水处理显著降低了土壤EC值、有机质、硝态氮、铵态氮、速效钾和有效磷的含量。荧光定量结果表明土壤淹水处理显著增加了细菌菌群丰度（P<0.05）,但降低了真菌菌群丰度。高通量测序结果表明,微生物群落组成在门水平上,淹水处理显著增加了放线菌门（Actinobacteria）和Myxococcota的相对丰度,降低了厚壁菌门（Firmicutes）和被孢霉门（Mortierellomycota）的相对丰度;在属水平上,淹水处理降低了潜在病原菌镰孢菌属（Fusarium）相对丰度并与土壤硝态氮呈显著正相关,增加了潜在固氮菌属中的固氮弧菌属（Azoarcus）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Sideroxydans、Candidatus_Solibacter、藓杆菌属（Bryobacter）及潜在有益菌属Aspergillus和枝顶孢霉属（Acremonium）的相对丰度,并与土壤硝态氮呈显著负相关;土壤硝态氮含量显著影响土壤细菌和真菌的群落结构。培养皿试验结果表明,淹水处理土壤中的辣椒种子发芽率、幼苗鲜重和根长显著高于不淹水处理土壤。【结论】 辣椒连作土壤淹水处理显著降低了EC值,降低了潜在病原菌和增加了潜在有益菌丰度,但土壤速效养分含量显著降低。同时,土壤淹水有利于辣椒种子萌发与幼苗生长,有利于缓解辣椒连作障碍。     

PEG-6000和NaCl胁迫对转GbWRKY32基因烟草种子萌发及苗期生长的影响

【目的】研究GbWRKY32基因的抗旱及耐盐功能。【方法】以转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草为材料,研究在不同浓度PEG-6000(0%、5%、10%、15%)以及不同浓度NaCl(0 mm、100 mm、150 mm、200 mm)处理下,对转GbWRKY32基因烟草种子萌发、全苗长、根系以及干重、鲜重的影响。【结果】(1)随着PEG-6000浓度的不断增加转GbWRKY32基因烟草种子与本生烟草种子萌发率全苗长、根系以及干重、鲜重不断降低;(2)在PEG-6000浓度达到15%处理14 d后,三个转GbWRKY32基因烟草株系的种子萌发率、全苗长、根系以及干重、鲜重明显高于本生烟草种子;(3)随着NaCl浓度的不断上升,其整体趋势与PEG胁迫相同;在NaCl浓度达到150 mm时,处理14 d以后三个转GbWRKY32基因烟草株系的种子萌发率、全苗长、根系以及干重、鲜重明显高于本生烟草种子;【结论】GbWRKY32基因转入烟草中可以明显提高烟草对干旱以及盐胁迫的抵御能力。     

系列抗稻瘟病水稻亲本抗性基因的经典遗传学分析

以福伊A、谷丰A和全丰A等抗稻瘟病水稻不育系选育系谱中的谷农13、天谷B、福伊B、谷丰B、全丰B为母本,以CO39为轮回亲本的6个近等基因系和感病对照丽江新团黑谷(LTH)为父本,组配了包括亲本(P)、F1、F2 3个世代的遗传材料.以3个稻瘟病菌系进行苗期室内喷雾接菌鉴定,应用经典遗传学分析方法研究该系谱中的5个供试...     

杂交稻种子贮藏技术及寿命预测研究

对水稻三系配套的雄性不育系、保持系、恢复系乃其杂交一代种子,在各种恒定的含水量和室温下贮存,测定其寿命变比。发现不育系和杂交一代种子的安全水分比保持系和恢复系的13％(国家标准对普通籼稻常规品种的最高限度)低2％;不育系和杂种一代种子水分在11％时、寿命变化最接近典型的反S形生存曲线,当发芽率降到80％左右时,生存曲线急速下降。根据典型生存曲线规律,拟配合新的寿命预测方程。     

基于宿主诱导的基因沉默技术创制抗拟轮枝镰孢玉米自交系

【目的】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）是一种主要的病原真菌,侵染玉米可以导致穗粒腐病、茎腐病、苗期根腐病及引起种子腐烂。由拟轮枝镰孢引起的病害不仅影响玉米的产量和品质,而且其病原菌代谢过程中产生的伏马菌素等多种真菌毒素严重威胁了人畜安全。通过宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术创制抗拟轮枝镰孢的玉米种质,为玉米抗病育种提供新的优异抗源。【方法】通过同源克隆方法克隆可能与拟轮枝镰孢生长发育相关的关键基因,并通过体外转录获得相应的dsRNA片段;将不同基因的dsRNA与拟轮枝镰孢的分生孢子悬浮液预混后,用于后续的体外RNA沉默试验;对感病玉米自交系西502的种子进行消毒与接种,在培养皿中28℃避光培养48 h,调查种子的发病程度;在混有dsRNA的孢子悬浮液中加入葡萄糖,25℃培养24 h后,在显微镜下观察孢子萌发与菌丝生长情况;将三叶期的西502幼苗转移至预混dsRNA的孢子悬浮液中进行培养,7 d后观察苗期根腐病发病状况;通过种子鉴定与苗期鉴定体系,逐步筛选具有显著抑制效果的沉默靶标基因;合成筛选出的重点靶标基因片段,构建沉默载体并转化感病玉米自交系西502;对转基因株系的种子接种鉴定,验证转化玉米株系的抗性;提取接种后转基因种子的总RNA,对拟轮枝镰孢的靶标基因进行荧光定量分析,确定HIGS株系的沉默效果。【结果】从拟轮枝镰孢中克隆出18个与其生长发育相关的候选基因;通过种子接种鉴定,发现11个候选基因被沉默后,种子的发病等级极显著降低;进一步筛选出6个沉默后影响拟轮枝镰孢的孢子萌发和菌丝生长的候选靶标基因deo、Ras2、Dpdc、Hsp90、Frp1和Atg15;通过苗期接种鉴定,最后筛选出3个在体外具有显著抑制效果的沉默靶标基因deo、Atg15和Frp1;进而将3个靶标基因的特异区段人工融合成一段序列并构建沉默载体,获得转基因植株;鉴定发现转基因植株的T₂代种子对拟轮枝镰孢的抗性显著增强,且3个靶标基因的表达量均显著下降。【结论】拟轮枝镰孢基因deo、Atg15、Frp1与其生长发育密切相关,且沉默后能够显著提升玉米对拟轮枝镰孢的抗性。     

滇重楼内生真菌的分离及其对滇重楼种子胚发育的效应(英文)

[目的]本研究旨在分离滇重楼的内生真菌并探究其对内生真菌胚发育的效应。[方法]分离滇重楼的内生真菌并进行形态学鉴定,并用石蜡切片和显微照相术研究内生真菌并探究其对滇重楼种子胚发育的效应。[结果]从滇重楼根状茎中分离到9种属于3目、5科、7属的内生真菌,即PPYEF-1,PPYEF-2,PPYEF-3,PPYEF-4,PPYEF-5,PPYEF-6,PPYEF-7,PPYEF-8和PPYEF-9。除了PPYEF-4(枝孢霉属)外,其他真菌都能促进滇重楼种子的胚发育,大多数达到极显著或显著水平;PPYEF-9(木霉属)能导致滇重楼种子发育的最长胚长和最高胚率。[结论]本文可为滇重楼内生真菌在打破滇重楼种子休眠中的应用提供参考。     

种胚特异性表达番茄SlABI3对水稻冈46B穗萌的抗性研究

【目的】利用水稻胚特异表达基因OsVP1的启动子驱动与OsVP1同源的番茄SlABI3在穗萌严重的水稻保持系冈46B中表达,以增强冈46B对穗萌的抗性,进而为改良水稻穗萌抗性的分子设计育种提供理论依据。【方法】构建SlABI3的胚特异表达载体pHB-OsVP1P::SlABI3,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入籼稻冈46B中,通过研究转基因和野生型植株的穗萌差异,验证种胚特异表达的SlABI3在穗萌抑制中的生理功能。【结果】获得了pHB-OsVP1P::SlABI3转冈46B的转基因植株;转基因植株种子的萌发速率较野生型冈46B慢,并且萌发后第8天转基因植株的苗长、根长显著（P<0.05）短于野生型冈46B;此外,在不同浓度ABA处理的试验中,随着ABA浓度的升高,转基因和野生型种子的萌发速率都呈现下降的趋势,但转基因种子的萌发速率均比野生型种子慢。【结论】SlABI3在水稻胚中特异表达能够降低种子的萌发速率并且抑制穗萌发生。     

玉米转录因子ZmEREB93负调控籽粒发育

【目的】玉米作为重要的粮、经、饲多用作物,其产量的稳定对经济发展和粮食安全意义重大。AP2/EREBP（APETALA2/ ethylene response element binding protein,AP2/EREBP）转录因子在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。前期研究发现,玉米ZmBES1/BZR1-5转录因子靶基因ZmEREB93可能参与调控种子大小。克隆ZmEREB93,并对其表达特性及功能进行分析,为深入解析其调控玉米籽粒发育的功能与机制奠定基础。【方法】从玉米自交系B73中克隆ZmEREB93的全长序列,对其基因序列和编码氨基酸序列特征进行生物信息学分析。随后,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）分析其组织表达模式,分别构建植物和酵母表达载体,进行亚细胞定位和转录激活活性分析。经农杆菌介导法将ZmEREB93转入拟南芥,对转基因株系的种子表型进行分析。最后,通过体外染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing,Chip-seq）和共表达分析筛选ZmEREB93可能调控的候选靶基因,并通过酵母单杂交（yeast one hybrid,Y1H）验证。【结果】成功克隆获得ZmEREB93,序列分析结果表明,ZmEREB93无内含子,开放阅读框长618 bp,编码205个氨基酸,有一个高度保守的AP2结构域,属于AP2家族的ERF亚类。qRT-PCR结果表明,ZmEREB93在授粉后15和25 d的种子中表达量较高,其中,在25 d种子中表达量最高,约为15 d种子中表达量的11倍,在茎和根中有微量表达,在雄穗、花丝及苞叶中无表达。转录激活试验结果表明,ZmEREB93蛋白在酵母细胞中不具有转录激活活性。亚细胞定位结果显示,ZmEREB93蛋白定位于细胞核。与野生型株系相比,转基因拟南芥株系种子的长和宽显著变小且千粒重显著降低。体外Chip-seq与共表达分析结果表明,Zm00001d013611、Zm00001d006016、Zm00001d027448及Zm00001d039991为ZmEREB93转录因子的候选靶基因。Y1H试验表明,ZmEREB93蛋白可直接结合Zm00001d013611启动子。【结论】玉米ZmEREB93作为转录因子在种子中特异性表达,负调控种子大小。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的培育

采用农杆菌介导的遗传转化法,将cry1Ab基因导入优良三系恢复系明恢63,共获得了92个独立转化株,其中13株为单拷贝。通过发芽试验,获得了11个单拷贝转基因纯合系。ELISA检测结果表明:不同株系其Bt蛋白含量不一样,但杂种的Bt蛋白含量与其亲本一致。室内人工接虫试验及田间抗虫性试验初步表明:5个纯合株系表现高度抗性,且农艺性状与原品种没有显著差异。由此说明,所获得的这些单拷贝转基因株系可作为育种材料,用于抗虫水稻的培育。     

杂交稻新选恢复系碾米品质与外观品质的分析

采用35个杂交稻新选恢复系与已在生产上获得推广的16个杂交稻两系或三系不育系随机配组成73个杂交稻组合,将各杂交稻稻组合杂种F1及其亲本在相同栽培环境条件下种植,对其收获各杂交稻组合与其亲本种子的碾米品质性状及外观品质性状进行了分析.结果表明:丰源A/R2032、P64S/R996、粤太A/R259、金23A/R52等杂交稻组合的碾米与外观品质表现优异;母本T98A、陆18S,父本R2773、保健红米适宜大面积推广配组;杂交稻组合整精米率受恢复系的影响不可忽视,73个杂交稻新选恢复系整精米率的一级优质米达标率为95.9％;杂交稻垩白性状的超亲优势表现明显;同时还发现不同杂交稻恢复系与同一杂交稻不育系配组的杂交稻组合、同一杂交稻恢复系与不同杂交稻不育系配组的杂交稻组合的碾米品质及外观品质各性状均表现不同;今后杂交稻及其亲本的碾米品质和外观品质改良重点是进一步提高糙米率和降低垩白度.