烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草(Nicotiana tabacum L.)碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体(nic1和nic2)中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1(nicotinesynthesis related splicing element 1)与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯(ET)和茉莉酸(JA)处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。     

Bacillus thuringiensis杀虫基因在花椰菜愈伤组织的整合与表达

 本文利用双元载体系统，通过土壤根癌农杆菌A281和B6S3菌株的介导，将B.t. aizawai 7-29杀虫蛋白基因导入我国栽培花椰菜品种瑞士雪球，得到转基因愈伤组织及其再生植株。Southern分子杂交证明B.t.杀虫蛋白基因已整合到花椰菜基因组中。用组织化学法检测GUS活性，观察到愈伤组织的转化细胞呈蓝色，由于B.t.杀虫蛋白基因与GUS基因翻译融合，GUS基因的表达为杀虫蛋白基因在花椰菜组织中表达提供了证据。     

转基因抗虫棉的培育

采用花粉管通道途径,将合成的Bt杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉所12,获得了转基因植株。组织化学分析表明,GUS标记基因已在R#-1代植株中表达。根据对GUS阳性转基因植株的PCR分析,证明Bt杀虫蛋白基因出现在R#-1代植株中,并通过自交传递至R#-2代。经抗虫性鉴定,获得了5株对棉铃虫有高度毒杀作用的R#-1代转基因抗虫植株S545、S591、S636、S1001（泗棉3号+Bt/GUS）和Zh1109（中棉所12+Bt/GUS）,对棉铃虫幼虫的致死率分别达到91.6%、93.8%、92.3%、85.7%和75.0%。通过自交和选育,获得了R#-5代转基因抗虫棉,并进行了抗虫性和转基因的跟踪鉴定,表明通过基因工程方法获得了抗棉铃虫的棉花新种质。     

LIR1基因在水稻中的组织特异性表达

水稻LIR1是LIR(light-induced rice)蛋白家族的一员,受光与生物钟的调节,在植物光反应及生物节律性调控方面有重要作用。为了研究水稻LIR1的生理功能,利用半定量RT-PCR技术对水稻‘珍汕97B’LIR1基因做了根、叶鞘、叶片及穗的组织特异性表达分析,同时构建了启动子的GUS基因融合表达载体LIR1∷GUS转化烟草,利用GUS组织化学染色检测GUS基因在烟草组织器官中的表达情况。研究结果表明:LIR1基因在水稻叶片中的表达量较高,而在叶鞘、穗与根中表达量较低;GUS染色主要集中在叶片组织及茎中,而在植株的根部不显色。     

融合杀虫基因植物表达载体的构建及转基因烟草的获得

 构建了人工合成的 GFM Cry IA杀虫基因和经过修饰的 Cp T 基因的融合杀虫基因高效植物表达载体p GBIF4 ABC。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 ,获得 4 2株卡那霉素抗性植株 ,经棉铃虫杀虫试验表明 ,3株表现高抗 ,14株表现中抗 ,2 5株感虫。对其中 7株烟草植株进行 PCR和 Southern印迹 ,4株烟草基因组中有融合杀虫基因的整合 ,为转基因植株。其中 2株的抗虫性为高抗 ,1株中抗 ,1株不抗     

基因枪轰击高粱愈伤组织获得转基因植株

利用基因枪轰击高粱幼穗愈伤组织，把Bt蛋白基因转移到体细胞中，在20mg／L潮霉素选择培养基上筛选到抗性愈伤组织，并分化出10株再生植株。对经过潮霉素抗性筛选再生的绿色植株取叶片进行GUS活性分析，从10株再生植株中GUS阳性反应的7株，另有3株无GUS表达。对GUS活性表达阳性的植株，利用：PCR和Southern杂交分析，对GUS活性表达阳性的植株7株中，6株扩增出0．6kb左右的DNA杂交信号带，说明Bt已整和到高粱基因组中。以基因枪法将Bt基因转移高粱愈伤组织过程中，高效的组织培养和再生体系的建立是转基因成功的重要因素之一。在遗传转化过程中应避免转基因的嵌合体现象，通过抗生素的浓度及培养时间，可以降低转基因的嵌合体频率。     

LYC-b基因反义表达对番茄果实番茄红素含量的影响

【目的】研究番茄红素β-环化酶(LYC-b)基因反义表达对番茄果实中番茄红素含量的影响,为番茄品质育种提供新方法。【方法】以番茄品种"TTI1117A"和"灵光3号"为材料,构建了分别由CaMV35S启动子驱动的GUS标记基因和反义LYC-b5′基因双价植物表达载体,通过农杆菌GV3101介导,将基因整合到番茄基因组中,采用GUS、PCR以及RT-PCR、Northern杂交进行检测,并测定了转基因植株果实中的番茄红素含量。【结果】由GUS、PCR检测结果可知,筛选出1株"TTI1117A"和4株"灵光3号"转基因植株;RT-PCR、Northern杂交检测结果表明,目的基因在RNA水平上已经表达;对番茄果实中番茄红素含量的测定结果表明,转基因植株果实中番茄红素含量均高于未转基因植株。【结论】LYC-b基因的反义表达具有提高番茄果实中番茄红素含量的作用。     

基因枪导入法培育抗虫水稻

以含潮霉素抗性基因，GUS基因和雪花莲凝集素（GNA）基因的pWRG1515和pRSSGNA1为供体DNA，利用基因枪法转化上农香糯成熟胚诱导的愈伤组织，经抗性培养基筛选，从轰击的135块愈伤组织中得5株转 基因植株，GUS检测和PCR分析表明，外源基因已转入并整合到水稻基因组DNA上。     

水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析

启动子是基因表达的重要调控元件。利用PCR方法克隆了控制水稻颖壳发育的候选基因TWH1的启动子,并将启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体。通过农杆菌介导的方法将其导入水稻愈伤组织,转基因植株经GUS染色分析显示,各个发育时期的茎秆、叶片、叶鞘、雌雄蕊和孕穗期的颖壳中都有GUS活性表达,但在根和抽穗后的颖壳中未检测到GUS活性。该结果对进一步研究TWH1基因的功能奠定了基础。     

转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因抗虫水稻的GUS和PCR辅助选择

报道了转基因抗虫水稻克螟稻1号（Ts-9)与非转基因恢复系川恢949、H97810－17及保持系212B等杂交F3代的GUS和PCR检测。GUS检测的结果，Ts-9与非转基因川恢949、97810－17杂交F2代有较多的GUS阳性植株。GUS阴性植株与阳性植株的分离比约为2：1。用设计合成的一对引物进行PCR扩增的结果，大部分GUS检测呈阳性的植株及一个保持系212B与Ts-9杂交F3代植株获得了大小约1200bp的PCR产物，即cryIA(b)基因片段。试验结果表明PCR是比GUS叶片染色更为灵敏、准确、方便的检测方法。     

浅析抗虫基因种类及抗虫原理

概述了目前植物抗虫基因工程中应用较广的Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因和动物源抗虫基因及抗虫原理,分析了抗虫基因植物面临的问题,提出了延缓害虫对转基因植物抗性的解决建议。     

5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析

分析已发表的植物1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因序列,设计一对简并引物,在随机选择的非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣cDNA中进行PCR扩增．结果表明,在5种植物花瓣中都能扩增出约800bp的特异片段,登录GenBank发现均未被注册,因此将序列提交到GenBank并获得了序列号．在NCBI上进行Blast比对,发现所克隆的5个Acs基因均与其他植物花瓣的ACS基因有一定的序列相似性,最高达94％,最低为80％．将5个ACS基因的片段进行多序列比较分析,发现茶梅ACS基因与山茶ACS基因的序列差异最小,序列相似性达99％．本试验设计的ACS基因简并引物在植物中有一定的通用性,后续可以适当调整引物的简并度,以得到高通用性的简并引物．     

菊花转抗虫基因植株的PCR快速鉴定

对经过卡那霉素抗性筛选所得到的菊花转苏云金芽胞杆菌毒蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株 ,利用改良SDS法提取菊花DNA ,然后利用NPTII引物对 6个菊花品种的抗性植株所提DNA进行PCR扩增 ,发现了符合NPTII基因片段大小的亮带 ,初步证实获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花植株。     

农杆菌介导葡萄糖氧化酶基因转化油菜

以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体材料,采用农杆菌介导法进行葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)基因的转化,经卡那霉素抗性筛选获得大量的不定芽.PCR检测结果显示其中22株呈阳性.淀粉-KI染色结果表明在转基因植株中检测到H2O2.在转基因植株×非转基因植株(F1代)中,卡那霉素抗性筛选显示86%的株系呈现典型的孟德尔单基因显性遗传.F1代盛花期茎秆菌核病活体接种结果证实,转基因植株后代菌核病抗性明显提高.证实GO基因已转入油菜植株中并得到有效表达.     

转BADH基因和mtlD基因花生幼苗抗盐性研究

[目的]研究转mtlD基因和BADH基因花生幼苗的抗盐性。[方法]通过根癌农杆菌介导将外源mtlD和BADH基因同时导入花生,并检测植株的鲜重、高度、电导率等指标以判断转基因花生的抗盐性。[结果]PCR和Northern杂交都显示,mtlD和BADH基因已成功整合到花生染色体上;转基因植株的鲜重、高度、细胞膜的完整程度都明显高于对照植株。[结论]mtlD基因和BADH基因在花生中的表达增强了转基因花生的抗盐性。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

园艺植物抗寒基因工程研究进展

抗寒基因工程的发展为防治园艺植物冻害提供了一条新途径.为此,综述了近年来国内外园艺植物抗寒基因工程的研究进展,概述了常用的抗寒基因,特别是抗寒基因在园艺植物转化上的方法和成效,并对发展前景阐述了观点和看法.     

SLB9基因沉默对番茄抗旱性的影响

SLB9基因是BES1转录因子家族中的一员,BES1在调控油菜素内酯(BR)基因响应中发挥关键作用。研究证明BES1基因受多种胁迫诱导,介导BR信号,调节植物耐旱等抗逆性。采用基因沉默(VIGS)技术,通过农杆菌介导法构建SLB9基因沉默植株,干旱胁迫处理沉默植株,通过观察沉默植株与对照植株表型差异及生理生化指标变化,研究SLB9基因表达变化对番茄抗旱性的影响。结果表明,SLB9基因沉默植株抗旱性明显低于对照植株,推测SLB9基因下调表达降低番茄抗旱性。     

表达 HarpinEa基因的转基因马铃薯的晚疫病抗性分析

 通过根癌农杆菌介导,用Harpin_Ea基因转化马铃薯四倍体栽培种大西洋（Atlantic）,获得107个马铃薯转化株系。经过卡那霉素的抗性鉴定和PCR分子检测,有59株PCR检测成阳性,占所有转化植株的55.14%.实验对部分转基因植株进行室内抗病性评价,从24个PCR阳性株系中筛选到9个株系的抗病性与对照相比有显著差异(P<0.05),其中7株的抗病性与对照相比差异极显著(P<0.001)。结果初步表明Harpin_Ea基因已整合到马铃薯的基因组中并得到表达,提高了植株的晚疫病抗性。     

The Function Identification of the Candidate Disease-Resistance Gene in Cabbage

In order to understand the function of TuR2, a candidate disease-resistance gene was isolated from cabbage, we transformed it into mustard （Brassicajuncea L. Linshicaoyaozi） which was susceptible to TuMV through Agrobacterium tumefacine-mediated method. Transgenic plants were detected by Southern blotting and Northern blotting. Our results confirmed that the TuR2 gene had been integrated into the mustard genome, and it showed different expression levels among primary transplants （T0）. The primary transplants （T0） and the first progenies of transgenic plants （T1） were inoculated with TuMV in a greenhouse. The transgenic plants had high TuMV-resistance, whereas the serious virus disease symptom was observed in CK （no transformation plants）. The TuR2 gene in the first progenies of transgenic plants （T1） showed dominant monogenic inheritance. Compared with CK, the progenies containing TuR2 gene had stronger resistance to TuMV. The TuR2 gene which was isolated from cabbage had the function of TuMV-resistance.