一种高效提取虎耳草科植物基因组DNA的方法

[目的]探索从虎耳草科植物中提取DNA的有效方法。[方法]采用改进的CTAB法,从11种虎耳草科植物中提取DNA。以提取的DNA为模板,利用通用引物"psbAF"和"trnHR"对虎耳草科植物叶绿体DNApsbA-trnH片段进行PCR扩增。[结果]通过该方法提取的DNA纯度较高,质量较好。用所得DNA进行psbA-trnH扩增的产量高,可用于后续的测序等分析。对山地虎耳草的PCR产物纯化后进行测序,得到262 bp的序列。将其与GenBank中的虎耳草属其他植物的psbA-trnH序列进行比对分析,证实该序列为目标psbA-trnH片段的区域。[结论]该方法可有效去除次生物质对DNA的干扰,提取的基因组DNA可用于叶绿体psbA-trnH测序分析和其他遗传学分析。     

桑黄基因组DNA提取方法优化及分子鉴定

本研究以桑黄为材料,筛选出一种快速直接提取子实体DNA的方法。利用CTAB法、试剂盒及硅珠DNA纯化技术分别对桑黄子实体基因组DNA进行提取,结果表明,硅珠DNA纯化技术的提取效果最好,试剂盒方法次之。经过PCR扩增和测序得到桑黄的rDNA ITS序列,通过BLAST比对及系统进化树构建,发现所检测的样品为哈尔蒂木层孔菌Phellinus hartigii。     

[鱼骨]属三种鱼类细胞色素b基因片段序列分析

用酚／氯仿提取法提取了唇[鱼骨]、花[鱼骨]和长吻[鱼骨]鱼鳍组织的总DNA,利用特异引物进行PCR扩增,得到1140bpCyt b基因片段,纯化后进行测序。所得同源序列用Mega3．1软件分析,并结合鮈亚科其它种类Cytb基因序列用NJ法和UPGMA法构建系统树。结果表明：（1）三种鱼Cytb基因片段序列碱基平均差异百分比为13．7％,变异位点201个,转换颠换比为4．6;（2）[鱼骨]属三种鱼类成一单系群,唇[鱼骨]与花[鱼骨]亲缘关系较近。     

基于I TS序列对紫薇的分子鉴定

对紫薇属植物细胞核核糖体DNA转录间隔区（nrDNA ITS）序列进行分析,为紫薇植物的鉴定提供分子依据。通过提取紫薇幼苗总DNA,对nrDNA ITS序列进行PCR扩增测序,应用软件BioEdit、DNAMAN 进行序列分析, MEGA计算遗传距离,构建基于K2P模型的NJ系统发育树。测序得到2条nrDNA ITS序列,长度均为615 bp。序列分析结果显示,序列1与紫薇ITS序列相似性达99．03％,遗传距离为0．003,聚类分析归为一支;序列2与毛紫薇ITS序列相似性达98．55％,遗传距离0．007,聚类分析归为一支。试验结果说明,基于nrDNA ITS序列分析法,能够对紫薇属植物进行准确的分子鉴定,从而为紫薇属的种类鉴定和种间亲缘关系提供分子生物学理论依据。     

猪Sarlb基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。     

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1.1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒.为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPV gp41基因的部分序列.序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低.     

12S rRNA、Cyt b基因标记在几类野生动物检材鉴定中的差异

【目的】通过比较线粒体DNA上的12S rRNA和Cyt b基因分子标记在几类野生动物物种鉴定中的效果差异,以确定基因标记技术在野生动物物种鉴定中的有效性。【方法】提取各类野生动物样本DNA,PCR扩增线粒体DNA上的12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段,对PCR产物进行电泳检测及测序分析,测序结果在Gen Bank上进行BLAST搜索,同源性分析。并将实验序列和NCBI上下载的与该序列存在同源性的序列用软件MEGA 7.0进行比对并构建进化树。【结果】从各类样本中成功地提取到了基因组总DNA,并成功扩增出了用于动物种属鉴定的12S rRNA基因片段、Cyt b基因片段。测序分析结果表明用12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段均可准确鉴定黑熊、藏羚羊、鬣羚、穿山甲样本的动物种属,但12S rRNA基因片段无法准确鉴定北山羊样本,BLAST搜索结果为其近缘物种山羊,而Cyt b基因片段却可准确鉴定北山羊。各样本基于12S rRNA、Cyt b基因序列构建进化树的结果与BLAST搜索结果相符。【结论】单一位点基因标记能够准确鉴别亲缘关系较远的物种。但对某些近缘物种,单一位点基因标记的鉴别能力较差,故野生动物物种鉴定宜选用2个以上的基因标记位点。     

藏药波棱瓜属药用植物DNA条形码鉴定

为评价DNA条形码候选序列对藏药波棱瓜属植物的鉴定作用,探讨波棱瓜属植物鉴定新方法,本研究采用不同产地、不同海拔波棱瓜植物的ITS2、PsbA-trnH、rbcL、matK通用引物对110份样品进行DNA提取、PCR扩增和测序,比较4条DNA序列扩增效率和测序成功率;分析种内和种间变异;通过Barcoding gap分析,构建NJ系统进化树,评价各序列对西藏自治区、云南省、四川省不同海拔波棱瓜药材的辨别能力。研究结果表明,ITS2序列在所研究的波棱瓜属药用植物中的扩增效率和测序成功率均为100%,其种内种间变异、Barcoding gap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势,以ITS2序列作为DNA条形码,可对波棱瓜进行准确、快速识别和鉴定,准确地弄清楚不同地区不同海拔所生长的波棱瓜之间的进化关系,为该药用植物的质量控制、安全用药及资源合理开发利用提供理论依据。     

一种鉴定菜用枸杞的新方法——nrDNA ITS测序法

[目的]拟从分子水平对菜用枸杞进行鉴定。[方法]利用nrDNA ITS(核糖体DNA基因内转录间隔区)碱基序列测定的方法对5份菜用枸杞资源进行碱基序列测定并分析序列差异。[结果]首次获得5种菜用枸杞nrDNA ITS区碱基序列,整个ITS序列长度变异范围为628~632 bp,平均为630 bp,共有79个变异位点,占12.5%,保守位点553,占87.5%。基于nrDNA ITS序列差异的品种聚结果与依据形态指标的是划分结果相符。[结论]nrDNA ITS区测序分析可作为分子水平鉴定菜用枸杞不同种质来源的又一途径。     

内蒙古绒山羊Hoxc9基因克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的Hoxc9基因序列和本实验室前期构建绒山羊cDNA文库中Hoxc9基因部分序列设计引物。利用PCR技术从内蒙古绒山羊血液基因组DNA中扩增了Hoxc9基因,目的基因片段纯化后连接到PMD19-T载体,将鉴定的重组质粒进行测序,测序结果通过与GenBank中序列比对分析,确定扩增序列为Hoxc9基因,将该基因DNA序列提交至GenBank,登录号为DQ873298,DNA序列长为3308bp,cDNA序列长783bp,编码260个氨基酸。在此基础上利用生物信息软件对该序列结构特征进行分析。     

16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及菌群结构

【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法(珠磨法、反复冻融法)、化学法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法,组合生成9种不同方法,即方法 1(CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 2(CTAB+SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 3(CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法)、方法 4(CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 5(CTAB+Lysozyme+反复冻融法)、方法 6(CTAB+Lysozyme+珠磨法)、方法 7(SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 8(SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 9(SDS+Lysozyme+珠磨法),同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit(方法 10)为对照,以这10种方法来提取瘤胃微生物基因组DNA,并通过DNA浓度、纯度、DNA电泳图等基本性质及16S r RNA高通量测序结果对其进行分析比较,同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结果】不同DNA提取方法效率比对结果显示,同样的化学及生物酶裂解条件下,结合珠磨法及反复冻融法能够显著地增强细胞裂解效率,提高DNA产量。其中方法 3及方法 6提取的DNA具有较高的浓度及纯度,方法 7—10缺乏CTAB阳离子去污剂,提取的DNA量显著低于其他方法(P0.05),除方法 2和8所提取的样品经多次试验,PCR产物目的条带太弱或未检测到外,其余8种方法提取的样品PCR产物目的条带大小正确,浓度合适,符合高通量测序的要求。16S r RNA高通量测序共生成了191 349条原始数据,质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分析表明,数据量合理并达到饱和,能够完整反映样品的菌群种类。OTU聚类数据统计、分类学和多样性指数分析显示方法 6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法 6裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上,方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨)提取的DNA产量、样品多样性指数及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括21门、35纲、75科、112属,丰度较高的菌群依次是拟杆菌Bacteroidtes(64%)、厚壁菌Firmicutes(20%)、螺旋体Spirochaetae(2.3%)和变形菌Proteobacteri(1.8%),纤维杆菌Fibrobacter(1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存在着一定的差异,这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用16S r RNA高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基因组DNA理想提取方法,即方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨),并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构,为研究牦牛瘤胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。     

一种提取真菌基因组DNA的新方法

真菌基因组高通量测序对DNA纯度和含量要求较高,通过月桂酸钠法、CTAB法和酶裂解法分别提取真菌基因组DNA,然后进行琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 1000测定DNA浓度和纯度,结果证明月桂酸钠法提取的真菌基因组总DNA更适合应用于真菌基因组高通量测序.     

一种从马鹿粪便中提取DNA的改进方法(英文)

[目的]介绍一个从马鹿粪便中提取DNA的改进方法。[方法]本实验采用的是,在传统的CTAB裂解法的基础下,根据马鹿粪便的特征摸索出来的改进方法。[结果]采用该方法从天山马鹿粪便中提取了高质量的粪便DNA并扩增了天山马鹿线粒体细胞色素b基因片段,通过测序检测,同时提取马鹿肌肉和皮毛样品的DNA作为对照,进一步证实了提取的可靠性。[结论]该方法提取过程中不需要用蛋白酶K;所提取的DNA不需要用DNA纯化试剂盒纯化,可直接用PCR扩增,因此,费用量很低。     

An Economics Approach to Hard Computational Problems

A general method for combining existing algorithms into new programs that are unequivocally preferable to any of the component algorithms is presented. This method, based on notions of risk in economics, offers a computational portfolio design procedure that can be used for a wide range of problems. Tested by solving a canonical NP-complete problem, the method can be used for problems ranging from the combinatorics of DNA sequencing to the completion of tasks in environments with resource contention, such as the World Wide Web.     

基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。     

一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法

[目的]筛选一种能够得到高质量桑树基因组DNA的方法。[方法]采用天根试剂盒法(Plant Genomic DNA Kit离心柱型),并稍加改进,从11个桑种的新鲜嫩叶中提取DNA。[结果]该方法简单快速,不需要复杂仪器,且能有效地除去桑叶中的多糖、多酚、蛋白质等杂质,得到的DNA能够满足RAD-Seq高通量的测序要求。[结论]建立了一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

高通量测序技术在转基因植物分子特征评价中的应用

分子特征是筛选和鉴别转化体重要依据，也是转基因植物安全评价必须提供的内容。DNA测序技术的发展为精准解析转基因植物的分子特征提供了新的技术方案。综述了高通量测序技术在转基因植物分子特征中的应用及欧盟和加拿大对转基因植物安全评价中所提供测序数据的要求，并提出了我国转基因植物安全评价中采纳测序数据时的建议，为高通量测序技术在我国转基因生物安全评价中的应用提供理论支撑。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。