Construction of full-length cDNA library and its EST sequence analysis in sugarcane root at seedling stage under drought stress

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95％,文库插入片段长度在500～2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5％和93.5％.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87％;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13％.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

打顶烟草根尖组织抑制性消减cDNA文库的构建及其序列分析

[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库.     

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础.     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.     

干旱和盐碱共胁迫玉米EST数据库分析

[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期（12片叶龄）的混合组织（叶、茎和花芽）总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的B lastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。     

干旱和盐碱共胁迫玉米EST数据库分析(英文)

[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期(12片叶龄)的混合组织(叶、茎和花芽)总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的BlastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。     

扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的克隆及序列分析

[目的]从扩展莫尼茨绦虫中克隆β微管蛋白基因,进行序列测定和生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——β微管蛋白基因,全长1571 bp,编码444个氨基酸,与日本血吸虫的β微管蛋白氨基酸序列具有78.6;的同源性.编码蛋白的理论分子量为49.6 ku,等电点为4.96;1 -4位氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140～146位GGGTGAG存在一个微管蛋白标志信号片段,在99～106位和391～410位存在两个典型的β微管蛋白保守区;亚细胞定位分析其为细胞的骨架蛋白.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

雌性东方蜜蜂基因表达差减文库的构建及初步分析

蜜蜂的蜂王和工蜂是两种不同的表型,这是基于基因的差异表达,而不是遗传物质的多态性。本研究以雌性东方蜜蜂为材料,利用抑制消减杂交技术构建东方蜜蜂蜂王和工蜂的基因差异表达的文库。挑选插入片段大于200 bp的330个阳性克隆进行测序,蜂王消减文库176个,工蜂消减文库154个。测序后蜂王消减文库获得161条ESTs序列,工蜂消减文库获得142条ESTs序列。获得的序列采用DNAstar seq Man软件进行载体、接头和低质量序列去除后进行ESTs分析,蜂王消减文库获得110个contings,工蜂消减文库获得81个contings,蜂王和工蜂文库均有部分重叠的ESTs序列。在NCBI上进行在线BLASTx和t BLASTn同源比较,发现在蜂王的ESTs中有62个已知ESTs,3个未知ESTs,工蜂的ESTs中有49个已知ESTs,8个未知ESTs。通过基因本体论进行功能分析,大部分差异表达的基因为酶类和结合蛋白,主要参与基因的转录、翻译和新陈代谢过程。雌性东方蜜蜂差减文库的构建,为进一步研究蜜蜂级型分化的机制奠定了基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.     

甘蔗水分胁迫响应相关醛脱氢酶基因的克隆及其表达特征分析

 【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH 的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1 914 bp,其中5′端非编码区25 bp,开放阅读框为1 581 bp,3′端非编码区306 bp,在1 749处有终止加A信号AATAA。克隆的甘蔗全长cDNA序列进行NCBI比对分析显示,所克隆的甘蔗SSADH全长cDNA与拟南芥（NM_106592.3）的ALDH5F1同源性为73%,表明克隆的cDNA序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基因ALDH5F1。通过荧光实时PCR分析SSADH表达表明,该基因参与干旱胁迫下的全程响应,并证明水分胁迫下该基因表达与Ca2+的存在调控关系。【结论】克隆了甘蔗基因SSADH,该基因为一个水分胁迫响应基因;SSADH的植物在体表达与Ca2+存在调控关系。克隆的基因SSADH可用于植物抗逆性调控研究。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（EST contig110和EST contig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列EST contig110和EST contig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对EST contig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)基因的克隆及序列分析

[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础.     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

棉花花药全生育期均一化全长cDNA文库的构建和分析

【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制,并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST,利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107,插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes,平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析,得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因,并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明,这些基因均在花药发育前期优势表达,尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因,并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。