酿酒酵母脂滴代谢突变体中细胞自噬缺陷检测条件的比较

[目的]以探讨参与脂滴代谢途径的一些基因缺失是否会影响细胞自噬为出发点,比较不同自噬检测方法所获得的试验结果的差异,用于优化自噬检测条件。[方法]首先用GFP标记自噬标志性蛋白Atg8以及mCherry标记脂滴蛋白Erg6并构建代表性自噬缺陷菌株,然后用普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜分别观察Atg8和Erg6的共定位情况。其次,利用生长表型检测和台盼蓝染色来检测磷脂基因相关突变体经氮饥饿处理后的细胞活性情况。最后,采用免疫印迹法检测磷脂合成突变体菌株cds1-DAmp经饥饿处理不同时间后细胞中GFP-Atg8的降解和prApe1的成熟情况。[结果]在营养丰富以及饥饿条件下,用普通荧光显微镜拍摄所统计出的m Cherry-Erg6与GFP-Atg8定位重叠结果高于用激光共聚焦拍摄所统计出的结果。长时间氮饥饿条件下,用生长表型检测和台盼蓝染色均能检测到与脂滴形态相关基因CHO1、MRPS35、CDS1缺失会显著影响细胞的存活率;但用生长表型检测发现CAX4缺失菌株存活显著低于野生型时,用台盼蓝染色检测发现CAX4缺失细胞存活率却与野生型无显著性差异。用免疫印迹法检测CDS1缺失菌株中自噬缺陷时,通过检测GFP-Atg8的降解,氮饥饿大于4 h时的CDS1缺失菌株中GFP-Atg8的降解能力显著低于野生型,但通过检测prApe1的成熟,CDS1缺失菌株中prApe1的成熟缺陷在各个时间段均可检测到。[结论]验证了酵母脂滴代谢途径中以CDS1为代表的相关基因参与了细胞自噬。不同的检测条件、方法等因素对检测结果产生较大影响,甚至会出现相反结论,建议在酿酒酵母中进行类似的自噬检测时需要同时结合多种试验方法与手段来获取数据,以便用于结论与分析。     

灰葡萄孢菌的诱变及其致病性研究

[目的]研究灰葡萄孢菌抗AbA(短梗霉素A)突变体的诱变方法与AbA对灰葡萄孢菌及其突变体细胞形态和致病力.[方法]以野生型灰葡萄孢菌为出发菌株,用不同浓度的EMS诱变和AbA筛选,获得抗AbA的突变菌株.[结果]AbA显著影响灰葡萄孢菌细胞形态,如孢子萌发延迟、芽管粗短、顶端分支增多、抑制菌丝生长,并且降低致病力.AbA对突变菌株细胞形态无影响,而对其致病力有一定的增强作用.[结论]确定了灰葡萄孢菌抗AbA突变体的诱变条件,证明了突变体能抵抗AbA对细胞形态和致病力的影响.     

山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的建立

[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响。[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1 884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒p EX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用透射电镜观察细胞自噬体的形成。[结果]成功构建了双荧光自噬报告载体,该载体能在山羊SC中表达,荧光显微镜下可见绿色荧光和红色荧光表达;饥饿处理后,该载体可以指示细胞中自噬泡的形成过程,且细胞自噬相关标记Beclin1 mRNA以及LC3Ⅱ/LC3ⅠmRNA比值和蛋白水平均显著上调,并能观察到初始自噬体的形成。[结论]获得的山羊SC可以作为后续试验的细胞模型;构建的双荧光pmCherry-EGFP-LC3自噬报告载体可为进一步研究山羊SC的自噬发生提供有效的工具。     

酿酒酵母中Tca17经Rab蛋白Ypt31参与囊泡运输和细胞自噬的研究

为了探讨蛋白质转运颗粒(TRAPP)复合体相关蛋白Tca17通过何种Rab蛋白参与囊泡运输和细胞自噬过程,用绿色荧光蛋白(GFP)标记野生型和TCA17敲除突变体中囊泡运输标志蛋白Snc1后,检测菌株生长和GFP-Snc1运输缺陷情况,并检测不同Rab蛋白对突变体的生长和GFP-Snc1运输缺陷的抑制情况。相应地,用GFP标记野生型和TCA17敲除突变体中细胞自噬标志蛋白Atg8后,检测菌株生长和在营养缺乏条件下GFP-Atg8的运输和降解缺陷情况,并检测不同Rab蛋白对突变体的生长和GFP-Atg8的运输及降解缺陷的抑制情况。结果表明:敲除TCA17导致菌株高温敏感,Snc1运输受阻以及Atg8运输和降解异常,过量表达Rab蛋白Ypt31能够抑制TCA17敲除突变体的囊泡运输和细胞自噬缺陷表型,而Rab蛋白Ypt1不具有类似功能,这说明Tca17通过Rab蛋白Ypt31参与囊泡运输和细胞自噬过程。     

自噬对DON诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响

[目的]本试验旨在研究自噬对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响。[方法]以不同质量浓度DON(0,125,250,500,1 000和2 000 ng·mL~(-1))处理对数生长期仔猪海马神经细胞24 h后,采用倒置显微镜、透射电镜观察DON对仔猪海马神经细胞形态和超微结构的影响;采用p EGFP-LC3质粒瞬时转染细胞,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的分布情况;采用Western blot检测DON对仔猪海马神经细胞自噬标志性蛋白LC3的表达;通过添加自噬激活剂雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂氯喹(CQ)来升高和降低细胞的自噬水平,CCK-8法检测细胞的存活率。[结果]不同质量浓度的DON均可诱导细胞自噬,自噬水平随着DON浓度的增加先上升后下降,在1 000 ng·mL~(-1)时达到峰值。与对照组相比,DON可显著抑制细胞存活率并诱导细胞发生明显的形态学变化,并呈剂量依赖性;随着DON浓度的升高,细胞LC3-Ⅱ含量先上升后下降,1 000 ng·mL~(-1)时,LC3-Ⅱ含量最高,差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。与DON处理组相比,自噬水平的上升显著提高细胞活性(P0.05),而自噬水平的下降显著降低细胞活性(P0.05)。[结论]DON可以引起仔猪海马神经细胞自噬水平的上升,激活的自噬对DON导致的细胞损伤具有一定的保护作用。     

酿酒酵母中Tca17经Rab蛋白Ypt31参与囊泡运输和细胞自噬的研究

为了探讨蛋白质转运颗粒(TRAPP)复合体相关蛋白Tca17通过何种Rab蛋白参与囊泡运输和细胞自噬过程,用绿色荧光蛋白(GFP)标记野生型和TCA17敲除突变体中囊泡运输标志蛋白Snc1后,检测菌株生长和GFP-Snc1运输缺陷情况,并检测不同Rab蛋白对突变体的生长和GFP-Snc1运输缺陷的抑制情况。相应地,用GFP标记野生型和TCA17敲除突变体中细胞自噬标志蛋白Atg8后,检测菌株生长和在营养缺乏条件下GFP-Atg8的运输和降解缺陷情况,并检测不同Rab蛋白对突变体的生长和GFP-Atg8的运输及降解缺陷的抑制情况。结果表明:敲除TCA17导致菌株高温敏感,Snc1运输受阻以及Atg8运输和降解异常,过量表达Rab蛋白Ypt31能够抑制TCA17敲除突变体的囊泡运输和细胞自噬缺陷表型,而Rab蛋白Ypt1不具有类似功能,这说明Tca17通过Rab蛋白Ypt31参与囊泡运输和细胞自噬过程。     

利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

[目的]随着人们生活水平的不断提高,具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎.水稻的香味性状主要受第8染色体上的BADH2基因控制,该基因突变造成稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉的积累而产生香味,加速香稻培育的进程.[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以适宜江西种植的粳稻台南11为研究材料,在BADH2基因的第3外显子处设计靶位点创制BADH2基因突变株系,利用潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株,经测序和PCR分析获得无转基因成分的稳定突变株系.利用气相色谱质谱联用仪测定野生型和T3代突变体材料中2-乙酰-1-吡咯啉的含量.考查分析野生型和T3代突变体材料的产量及品质.[结果]成功获得了BADH2基因突变株系,对这些株系进行鉴定分析,获得4种突变类型,其中插入突变1种,缺失突变3种;突变体材料中的2-乙酰-1-吡咯啉较野生型含量均显著提高;与野生型相比,突变体材料中的有效分蘖数、每穗总粒数、结实率等产量性状呈现显著性差异,产量平均减少8.7％;突变体材料中的蛋白质含量、整精米率、垩白度、长宽比等品质相关性状与野生型相比呈现显著性差异,品质在一定程度上有所提高.[结论]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功对水稻中的BADH2基因进行了敲除,显著提高了水稻中香味物质的积累,缩短了培育香稻的时间,为进一步选育香稻提供理论技术和材料支撑.     

口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

[目的]探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生,分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法]用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒,通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果]自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加,并且LC3特异的绿色荧光聚集;自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论]Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬,而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。     

苹果树腐烂病菌小G蛋白VmRab7基因的功能分析

苹果树腐烂病菌（Valsa mali）引起的真菌病害严重制约着苹果经济产业的发展,深入研究其致病机制,对该病害的防控十分重要。初步鉴定了小G蛋白VmRab7的功能,为解析苹果树腐烂病菌的致病机理和病害防控提供理论依据。采用同源重组的方法对VmRAB7进行基因敲除,获得ΔVmrab7敲除突变体;通过菌落直径的测量,分析VmRab7对菌丝生长速率的影响;通过离体枝条和叶片接种,分析VmRab7对致病力的影响;通过透射电镜观察,分析ΔVmrab7突变体的自噬体及液泡形态。研究发现,VmRAB7基因的缺失使菌丝生长速率降低了约40%,致病力降低了约50%,突变体丧失了产孢能力;ΔVmrab7敲除突变体具有小且多的碎片化液泡,液泡中无球状的自噬体结构。因此,VmRab7调控着苹果树腐烂病菌的营养生长、产孢、致病力、液泡融合和细胞自噬过程。     

脉胞菌lca-1基因调控无性产孢及类胡萝卜素的合成(英文)

[目的]为了深入了解粗糙脉胞菌类胡萝卜素合成调控机制。[方法]该研究通过对粗糙脉胞菌基因突变体库中6087株突变体进行筛选,并对突变体类胡萝卜素与无性孢子的产量进行测定;最后采用实时荧光定量RT-PCR技术对无性产孢及类胡萝卜素合成相关基因进行转录分析。[结果]新发现6个基因敲除突变体营养生长正常,但类胡萝卜素的合成降低,其中表型较好的1个突变体,其无性产孢量与类胡萝卜素合成量均明显降低。该突变体所缺失的基因编码一种依赖ATP的染色体重建复合体的ATP酶链ISW1,我们将该基因命名为lca-1。进一步测定发现lca-1基因的突变导致无性产孢及类胡萝卜素的合成量较野生菌株分别降低了88%和81%。[结论]lca-1对脉胞菌的无性产孢和类胡萝卜素合成具有重要的正调控作用。     

抓住机遇求发展把握市场促效益--浅谈湟源县种子建设"十五"发展思路

随着西部大开发战略的实施,种子工作紧紧围绕我县压麦、增油、扩豆、抓菜发展特色农业总体构想,必须立足我县种子工作的实际,质量为根本,效益为中心;以多渠道增加投入为手段;以引繁推优良品种求发展,走种子产业化、品种布局区域化、加工机械化、质量标准化、包装商品化、经营规模化、管理法制化的路子.在"十五"期间种子工作重点做好以下四个突破,三个扩大,一个引种.     

提高牛冷配受胎率的几点看法

1仔细观察发情,鉴定要准确,输精求适时适时输精是提高母牛受胎率的关键,为此要认真仔细的观察、准确判断把握排卵期。发情母牛最佳输精时间:一是发情母牛阴门肿胀刚开始消退,颜色变为紫红色;二是由乱跑鸣叫变为安静,不躲避人;三是手抓牛尾有拱背表现;四是输精器插入阴道后牛尾高举,阴户收缩,呈排尿姿势或立即排尿等;五是直肠     

Source parameters for stick-slip and for earthquakes

Source parameters of stick-slip friction events measured in the laboratory show particle and rupture propagation velocities which are similar to those observed for earthquakes and inferred from seismic source theory. This dynamic similarity strongly supports the idea that stick-slip is the mechanism for shallow earthquakes.     

构建社会主义和谐社会的理论基础

社会和谐是社会主义的本质属性和内在要求。构建社会主义和谐社会有赖于经济发展、制度完善和社会公正。构建社会主义和谐社会既要大力弘扬中华民族的传统和谐思想文化,又要借鉴世界文明成果。     

美国环保署农药地下水风险评估模型

在介绍美国农药环境风险评估的概念、分级、地下水农药监测情况及水资源的立法保护等基础上,重点阐述了美国环保署在农药登记管理过程中使用的2个地下水风险评估模型,即SCI-GROW和PRZM-GW模型。SCI-GROW是以好氧条件土壤半衰期和土壤有机碳分配系数为自变量的经验线性回归模型,而PRZM-GW则是描述农药在土壤中运动的一维、有限差分模型。本文通过对美国环保署这2个特点鲜明的模型的介绍,希望能为我国的农药地下水风险评估及模型的开发提供一个新视角。     

石油污染土壤微生物治理技术发展方向

采油废水和含油固体废弃物的排放,在一些区域造成了严重的土壤石油污染.经济而无二次污染的微生物石油污染土壤治理技术具有难以比拟的优势,其实质是通过对石油污染土壤微生物群落进行定向调控,充分发挥功能微生物的石油污染治理作用,强化对石油烃类污染物质的转化,从而达到石油污染治理和污染土壤修复的目的.     

测土施肥田间试验地块的选择与处理技术

针对测土施肥田间试验的地块选择、试验方案的布置设计以及试验小区的整理与区划进行了细致阐述。测土施肥技术的推广应用能够有效提高地力和肥效,对基层农业科技工作者从事试验示范和推广应用具有重要的指导意义。