番茄根特异表达基因LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论克隆获得了番茄LeGRP2基因启动子,该启动子主要在转基因拟南芥根部表达GUS基因,具有较强的根表达特异性。     

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

黑果枸杞及其白色果实F3′5′H基因启动子克隆及活性分析

通过3次染色体步移克隆出黑果枸杞及其白化果实F3′5′H基因的启动子片段并测序。分析发现2个启动子序列的同源性高达90.3%,对启动子序列进行预测,发现两者中均具有TATA-Box、CAAT-Box、TCrich repeats、WUN-motif、Sp1、Box I、G-box、skin-1motif及ARE元件。另外在黑果枸杞启动子中预测到与茉莉酸甲酯响应相关的元件TGACG-motif,而在黑果枸杞白化果实启动子中没有预测到。将2个启动子片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法转化烟草叶片,通过组织化学染色来确定启动子的启动活性。结果表明2个启动子均具有启动活性,利用荧光定量对2个启动子所驱动的GUS基因的表达量进行了分析,结果表明黑果枸杞启动子所驱动的GUS基因的表达量是黑果枸杞白化果实的3.09倍。     

LYC-b基因反义表达对番茄果实番茄红素含量的影响

【目的】研究番茄红素β-环化酶(LYC-b)基因反义表达对番茄果实中番茄红素含量的影响,为番茄品质育种提供新方法。【方法】以番茄品种"TTI1117A"和"灵光3号"为材料,构建了分别由CaMV35S启动子驱动的GUS标记基因和反义LYC-b5′基因双价植物表达载体,通过农杆菌GV3101介导,将基因整合到番茄基因组中,采用GUS、PCR以及RT-PCR、Northern杂交进行检测,并测定了转基因植株果实中的番茄红素含量。【结果】由GUS、PCR检测结果可知,筛选出1株"TTI1117A"和4株"灵光3号"转基因植株;RT-PCR、Northern杂交检测结果表明,目的基因在RNA水平上已经表达;对番茄果实中番茄红素含量的测定结果表明,转基因植株果实中番茄红素含量均高于未转基因植株。【结论】LYC-b基因的反义表达具有提高番茄果实中番茄红素含量的作用。     

草莓ARF4基因启动子的克隆及转录活性分析

草莓果实成熟的早晚,直接影响果农的收益。课题组前期研究发现,草莓ARF4基因能够调控草莓开花时间。启动子是基因转录的开关,其转录活性影响着基因表达的强弱。克隆ARF4基因启动子并分析其转录活性,对进一步明确ARF4基因的功能具有重要意义。根据草莓基因组信息设计特异引物,克隆草莓ARF4基因启动子。使用Plant CARE在线软件,预测其序列上的顺式作用元件。将ARF4启动子进行分段缺失克隆,利用农杆菌介导的果实注射法及GUS组织染色,确定GUS基因表达的强弱。通过农杆菌介导的叶盘转化法,获得转proARF4::GUS基因草莓植株,利用GUS组织染色法分析启动子的组织表达特异性。对转基因草莓植株进行非生物胁迫处理,通过qRT-PCR方法确定影响ARF4基因启动子转录活性的因素。结果表明:在ARF4基因启动子序列上,除了存在基本的核心元件外,还包含一些光响应、胁迫响应、厌氧诱导及激素响应等作用元件。GUS组织染色结果显示,随着启动子序列长度逐渐变短,GUS基因表达变弱。在转proARF4::GUS基因草莓植株叶柄、嫩叶及新茎中GUS表达水平较高,且在嫩叶中表达量最高。在非生物胁迫处理下,IAA和GA可使GUS基因表达显著提高。这些结果提供了影响ARF4基因表达的相关因素,为调控草莓开花时间奠定了基础。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

香蕉凝集素基因启动子5′远端的分离分析及鉴定

在已知香蕉果实特异表达凝集素(BanLec)启动子670 bp序列的基础上,利用染色体步移方法,克隆获得该段序列5′端上游远端序列330 bp,从而得到该启动子1 000 bp序列。通过Promoter predictions、Plant CARE软件分析表明,新获得的BanLec启动子5′端330 bp序列中具有更多组织特异性表达调控元件。构建总长度为1 000 bp的BanLec启动子表达载体,以35 S启动子和原有670 bp长度BanLec启动子表达载体为对照,利用基因枪转化香蕉根、叶和果实,测量GUS基因和GFP基因瞬时表达,结果证明长度为1 000 bp BanLec启动子为果实特异表达启动子,启动活性高于原有的670 bp BanLec启动子和35S启动子。     

油菜油体蛋白基因启动子的克隆及在油葵中的功能验证

利用PCR技术,从油菜(Brassica campestris)基因组DNA中克隆20 ku油体蛋白基因上游903 bp的调控序列NOP,将其与GUS基因融合构建植物表达载体,利用花粉管通道法转化油葵并进行PCR扩增,组织化学染色检测启动子和GUS基因在油葵基因组中的整合和表达情况。结果表明,NOP序列1~903 bp与报道序列同源性为95%,包含驱动基因表达的重要元件及驱动基因在种子中特异表达所必需的核苷酸序列;目的片段已整合到油葵基因组中,NOP具有种子特异性启动子的功能,能够驱动GUS基因在油葵种子中特异性表达,而在油葵根、茎、叶中均不表达。     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对番茄的转化

利用PCR技术从烟草中克隆获得了893bp的根特异性表达基因TobRB7的启动子,命名为NT1.以pBI121为原始植物表达载体,用NT1启动子和番茄广谱抗病基因Pto分别取代CaMV 35S启动子和GUS基因,获得了烟草根特异启动子驱动抗病基因的表达载体,命名为pBI-NT1::Pto.采用冻融法将pBI-NT1::Pto导入根癌农杆菌EHA105中,以番茄子叶为外植体进行了侵染转化.PCR检测NPT II基因的结果表明已获得转基因番茄植株.     

Isolation and Characterization of E11 Gene Promoter from Tomato

A fragment of 2 000 bp upstream sequence of E11 clone was amplified from genomic DNA of the tomato cultivar Zhongshu5. Sequence analysis showed that the upstream contains the regulatory elements: TATA box (-29 - -22), CAAT box (-193- -189), wound, and drought response elements. Expression vectors of E11 promoter gus fusion were constructed with the promoters of 1 200 and 2 000 bp regions, respectively. Transgenic tomato plants were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Histochemical analysis of GUS activity in various tissues showed that the two promoters were able to direct fruit-specific gene expression. The expression driven by promoter of 2 000 bp upstream fragment could increase GUS activity with the maturation of tomato fruits. The promoter of -1 200 bp fragment could direct gus gene expression in fruits with the inductions of drought and wounding. The regulatory region for fruit-specificity was probably located in the region of 1200 bp of 5'-flanking sequence and some positive regulatory elements or enhancers may exist in the region from -1200 to -2000 bp.     

番茄果实蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登记的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计特异引物,采用RT-PCR方法,从番茄自交系20-19果实总RNA中克隆到目的基因的全长 cDNA。序列分析表明,它与Gen Bank中登记号为AB051216的番茄蔗糖磷酸合成酶基因高度同源,核苷酸序列的同源性为98%。该基因已在GenBank中注册,登记号为AY726439。     

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

酵母SAMDC基因表达载体构建以及农杆菌介导转化番茄的研究

SAMDC(腺苷甲硫氨酸脱羧酶)是参与植物多胺合成的一个关键酶.通过GenBank上已经发表的序列,设计两对引物,分别以酵母基因组DNA和番茄基因组DNA为模板克隆出SAMDC基因和E8启动子.构建了以CaMV35S和E8为启动子的两个SAMDC基因植物表达载体,酶切分子鉴定后,经农杆菌介导以叶盘法转入番茄中,获得了转基因植株.经PCR检测和X-Gluc组织化学染色检测,目的基因已经成功转入番茄中.为研究多胺在番茄中代谢活性以及SAMDC基因对番茄抗逆性和番茄果色的影响提供了研究基础.     

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆与特异表达（英文）

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。