小麦Wrab18基因在小麦与叶锈菌互作中的功能研究

小麦Wrab基因家族分离于一种抗寒性小麦品种,该家族基因受冷胁迫或脱落酸诱导,在冷胁迫或脱落酸诱导后有高表达。通过构建转录组数据库,发现Wrab18基因在小麦抵抗叶锈菌侵染的过程中有明显上调。本试验以小麦品种‘洛夫林10’(简称‘L10’)与叶锈菌生理小种260组成不亲和组合,采用RT-PCR技术克隆Wrab18全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测Wrab18基因的表达;利用VIGS技术沉默Wrab18基因后,探究Wrab18基因在小麦与叶锈菌互作过程中的作用。结果克隆得到510bp的Wrab18基因开放阅读框全长,生物信息学分析表明,Wrab18可能不含有跨膜结构,为亲水性蛋白;亚细胞定位显示Wrab18定位于细胞质及细胞核中;Wrab18基因在接菌后8h表达量有明显增高;通过VIGS技术沉默‘L10’中的Wrab18基因,在接种叶锈菌后96h,发现叶锈菌的吸器母细胞数量增多,引起的小麦HR细胞面积增大,表明Wrab18基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的过程,并在该过程中发挥正调控作用。     

小麦与叶锈菌互作过程中TaCDPKs的表达分析

根据NCBI上公布的14个TaCDPK基因序列分别设计特异引物,将小麦品种‘洛夫林10’分别与叶锈菌生理小种260和165组成不亲和组合与亲和组合,在接菌后不同时间点分别取样,利用实时定量PCR技术检测14个TaCDPK基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达谱。结果显示,14个TaCDPK基因的表达模式可分为4类:TaCPK1、TaCPK2、TaCPK6、TaCPK7在叶锈菌侵染早期2个组合中的表达量均明显升高;TaCPK3、TaCPK18、TaCPK19在叶锈菌侵染早期2个组合中的表达量均明显下降;而TaCPK5、TaCPK8、TaCPK9、TaCPK12、TaCPK13、TaCPK15的表达量在不同组合中随接种时间的延长变化不明显;另外,TaCPK4在2种组合中前期表达量并无明显差异,但是接种后48h在不亲和组合中的表达量明显升高,而亲和组合中的表达量基本没有变化。结果表明,TaCPK1、TaCPK2、TaCPK6、TaCPK7、TaCPK3、TaCPK18、TaCPK19、TaCPK4可能参与小麦抵抗叶锈菌侵染过程;而TaCPK5、TaCPK8、TaCPK9、TaCPK12、TaCPK13、TaCPK15在小麦抗叶锈菌侵染中可能不起作用。     

TaCDPK6在小麦与叶锈菌互作过程中的表达模式分析

为了深入探究钙依赖蛋白激酶(Calcium dependent protein kinase,CDPK)在小麦与叶锈菌互作过程中的功能机制,本试验结合叶锈菌生理小种260侵染小麦品种Tc Lr26后的RNA-seq数据和NCBI基因组数据筛选得到抗病相关基因TaCDPK6,并对TaCDPK6进行了蛋白质理化性质分析;利用RT-qPCR和Western blotting技术检测TaCDPK6基因及其表达蛋白在小麦与叶锈菌互作过程中的表达模式。结果表明,TaCDPK6蛋白分子大小为57 kD,理论等电点为7.61,为亲水性蛋白质;在小麦叶片接种叶锈菌后,随着接种时间的延长,目的基因及蛋白呈先上升后下降的表达趋势,并且在4～8 h表达量达到最高,与RNA-seq数据分析得到的表达趋势基本一致。结果表明TaCDPK6在小麦抵抗叶锈菌的基础防御反应中可能发挥正调控作用。     

小麦与叶锈菌互作过程中LRRs类基因在转录水平的表达分析

本试验以小麦近等基因系TcLr26和Thatcher分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和及亲和组合,基于RNA-Seq高通量测序数据库,通过基因表达差异分析,筛选了6个在接种后较0h表达明显变化的属于LRRs类基因的Unigenes,利用实时定量PCR(RT-qPCR)技术对这6个LRRs类基因在接种叶锈菌后的表达进行了分析,为深入研究这些LRRs类蛋白在小麦抗叶锈菌侵染过程中的作用机制奠定了重要试验基础。     

TaCBL基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析

利用实时定量PCR技术对小麦与叶锈菌互作过程中的钙调磷酸酶B类似蛋白相关基因的表达进行了检测分析。结果表明,在亲和组合接种后的16h,TaCBL1、TaCBL3、TaCBL4、TaCBL7基因的相对表达量明显增加,分别达到了对照的近8,2,4.5,14倍的水平,而在不亲和组合中,这4个基因在不同时间点的表达水平与对照相近;TaCBL2和TaCBL9的表达趋势在亲和组合和不亲和组合间大致相似,但在不亲和组合中其表达的峰值出现的时间要早于亲和组合;TaCBL6在2个组合的表达变化基本一致。以上结果初步表明,TaCBL可能参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的基础防卫反应,其中TaCBL2和TaCBL9在抵抗叶锈菌侵染过程中发挥正调控作用,而TaCBL1、TaCBL3、TaCBL4和TaCBL7的高表达削弱了寄主的抗病性从而更利于叶锈菌的侵染。为进一步深入研究Ca2+信号通路中钙调磷酸酶B类基因在小麦与叶锈菌互作过程中的作用机制奠定了试验基础。     

条锈菌诱导的小麦C3HC4型锌指蛋白基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中首次分离出1个条锈菌诱导的编码C3HC4型锌指蛋白基因的cDNA序列,暂被命名为TaZFP1。TaZFP1包含一个完整的849 bp的开放阅读框,编码282个氨基酸,具有C3HC4保守结构域;小麦TaZFP1氨基酸序列与水稻OsZFP1相似性达89%,与玉米ZmZFP1相似性达81%。TaZFP1在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaZFP1基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合,表明TaZFP1可能参与小麦对条锈菌的防御反应。     

叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白,了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽,编码定位于液泡的碱性蛋白,蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性,与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近,与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异,总体上,该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达,该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加,并在接菌后48 h达到表达高峰;而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达;在茎中接菌后48 h开始有少量表达,但表达量变化不大,趋于平缓,总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期,除1叶期外,该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达,Mock（未接菌处理）反应中,TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势;接种叶锈菌后,TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应,且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）均能诱导该基因的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导,TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路,并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。     

叶锈菌侵染诱导产生的小麦Wrab17蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病是影响世界小麦生产的重要病害之一。研究小麦抗叶锈相关防卫蛋白的表达,对于深入研究小麦对叶锈菌的抗病机制,更好地为农业生产服务,具有重要意义。Wrab17(Wheat response to ABA)是一个冷胁迫诱导蛋白,前期工作通过构建叶锈菌侵染早期的小麦SSH文库及ESTs序列分析,筛选到Wrab17基因在不亲和组合接种后早期显著上调表达,初步表明Wrab17基因可能参与了小麦抗叶锈菌侵染过程,这是首次发现Wrab17参与抗病反应。本研究进一步利用RT-PCR技术从接种叶锈菌的小麦叶片中克隆获得了Wrab17基因的CDS区,构建了Wrab17蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达Wrab17蛋白。利用镍柱亲和层析方法获得了纯度较高的重组蛋白,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,得到特异性较好的多克隆抗体。为进一步通过Western Blotting技术检测Wrab17在小麦被叶锈菌侵染后不同时间点表达量的变化,明确Wrab17参与小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应奠定基础。     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TaLr35PR2蛋白的表达分析

为明确小麦TaLr35PR2蛋白在叶锈菌和信号分子诱导下的表达模式,在前期研究工作基础上,成功构建了TaLr35PR2基因的原核表达载TaLr35PR2-pEASY,在大肠杆菌中高效表达分子量约为30kDa的融合蛋白,采用Western杂交分析了TaLr35PR2蛋白在叶锈菌、水杨酸(Salicylic acid,SA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)诱导下的表达水平。结果表明,小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2蛋白在亲和反应(Thatcher)中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应(TcLr35)中的表达量变化较大,在接种叶锈菌后不同时间点有明显的上升或下调,且在非亲和组合中的表达量明显高于亲和组合。另外,信号分子可以诱导TaLr35PR2蛋白的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,TaLr35PR2蛋白表达量显著上调。这些研究结果首次从蛋白表达水平明确叶锈菌和信号分子SA、ABA显著诱导TaLr35PR2蛋白的表达,推测TaLr35PR2可能与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应具有一定相关性。     

小麦3种锈菌PCWDEs家族基因鉴定及表达分析

为挖掘小麦锈菌侵染过程中发挥关键作用的植物细胞壁降解酶（Plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs）基因,通过生物信息学方法对小麦3种锈菌（叶锈菌、条锈菌和秆锈菌）基因组中的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes, CAZymes）进行预测分析,在此基础上对其中的PCWDEs基因家族进行全基因组范围的筛选鉴定,并利用qRT-PCR方法对叶锈菌PCWDEs家族成员在侵染过程中的转录水平进行了检测分析。结果表明：1）小麦叶锈菌、条锈菌和秆锈菌基因组分别编码355、322和345个CAZymes家族成员基因以及160、153和158个PCWDEs基因;小麦3种锈菌共含75个保守CAZymes基因亚家族和94个PCWDEs直系同源基因簇。2)16个叶锈菌特异性PCWDEs基因在亲和（Pt15-‘中国春’）/非亲和（Pt15-‘云麦34’）互作过程中均受到不同程度的诱导表达,但非亲和互作中在侵染更早期就已受到诱导上调表达。3）叶锈菌特异性PCWDEs基因簇中有4个PCWDEs被鉴定为类扩展蛋白,其在侵染过程中受到诱导表达,说...     

小麦CBL结合蛋白激酶TaCIPK31负调控TcLr37对小麦叶锈菌的抗性

CIPK是植物特有的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族中的一类SnRK3激酶(SNF1-related protein kinase3),一般与类钙调磷酸酶亚基B类蛋白CBL(calcineurin B-like protein)相互作用形成信号网络,从而在钙信号介导的生理生化过程中发挥作用。克隆获得小麦中CIPK基因家族的TaCIPK31,其全长1 350 bp,编码449个氨基酸,包含保守的激酶催化结构域及调控结构域,与已报道的粗山羊草、水稻等CIPK蛋白具有高度相似性。定量分析结果表明,TaCIPK31在小麦-叶锈菌亲和反应中显著上调诱导表达。烟草亚细胞定位表明该基因分布于整个细胞。通过病毒诱导的基因沉默研究发现沉默TaCIPK31后小麦材料TcLr37对叶锈菌毒性小种THTT抗性增强。此外,详细的组织学分析表明,TaCIPK31沉默植株中推迟了病原菌在寄主中的定殖。推测TaCIPK31在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中起负调控作用,该结果对揭示CIPK蛋白激酶在小麦-叶锈菌互作体系的作用及分子机理提供参考。     

小麦叶锈菌与TcLr19非亲和互作cDNA文库的EST分析

 【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。     

小麦条锈菌一个产孢相关基因PsCon1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦条锈菌产孢相关基因PsCon1,分析其在病菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PsCon1的cDNA序列和基因组序列,采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域等基本特性,运用实时荧光定量RT-PCR技术分析PsCon1在夏孢子,芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PsCon1由3个外显子和2个内含子构成,开放阅读框长为252bp,编码83个氨基酸;编码的蛋白PSCON1不含跨膜区,无信号肽,定位在细胞质,具有2个conidiation-specific protein6保守结构域。PsCon1与小麦秆锈菌核苷酸序列的一致性在外显子区为78%,内含子区为43%,与小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的亲缘关系最近,与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和费氏新萨托(Neosartorya fischeri)的亲缘关系次之。PsCon1在小麦条锈菌萌发夏孢子时期基因表达量为新鲜夏孢子中的1.69倍。在亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后6h和24h表达量最高,分别为在新鲜夏孢子中表达量的3.21倍和2.91倍;在接种后24h至168h,基因表达基本呈下调趋势,在接种后168h的表达量最低,仅为夏孢子时期的0.0004倍,在接种后216h和264h,表达量有所增加,表达量约为接种后168h的15倍。在非亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后36h表达量最高,但仅为新鲜夏孢子基因表达量的0.13倍,基因表达总体呈下调趋势。【结论】PsCon1参与了小麦条锈菌对小麦的侵染,可能作为一个致病相关基因影响了条锈菌芽管和吸器的形成,同时促进了条锈菌在侵染过程中的产孢。PsCon1的克隆为进一步研究该基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能奠定了基础。     

转录因子TaMADS2在小麦-叶锈菌互作中的功能研究

为探究转录因子TaMADS2在小麦抗叶锈病中的功能，以TaMADS2基因在亲和/非亲和小麦与叶锈菌互作过程中上调表达，且在非亲和组合中上调表达时期较亲和组合更早为依据，利用BSMV-VIGS技术沉默‘中国春’‘郑麦9023’中TaMADS2基因表达，观察TaMADS2沉默植株的表型以及病程相关基因的转录水平变化。结果表明:在接种叶锈菌后，TaMADS2基因沉默植株较对照相比叶锈菌感染加重，单侵染点处活性氧积累面积减小，菌丝长度增加，发病面积增大，促进了病原菌的生长，减弱了植物的抗性反应；通过qRT-PCR分析发现在叶锈菌侵染早期，病程相关基因TaPR1和TaPR2的表达水平下调。综上，TaMADS2基因可能通过调控抗病相关基因的表达正向调控小麦对叶锈菌的抗性。     

小麦被叶锈菌侵染后ATPase活性及定位分析

用抗叶锈性不同的三个小麦品种 (洛夫林10、冀麦三号和5389) 分别接种两个毒力不同的叶锈菌 (puccinia rccondita f.sp.tritici) 小种 (366和165)、组成已知亲和程度不同的品种—小种组合。结果表明,不亲和组合接种后36h,ATPase活性峰值大而高,组织定位显示ATPase活性提高的部位位于侵柴菌丝接触的细胞及相邻细胞的胞壁和质膜附近;亲和组合接种48h以后,ATPase活性下降,并低于对照水平,组织定位未发现侵染细胞ATPase活性的增强;接种72h以后,侵染菌丝有较高的ATPase活性;慢锈组合ATPase活性介于亲和与不亲和组合之间。     

TaNPR1 在小麦抵抗叶锈菌过程中的作用

叶锈病是一种影响小麦(Triticum aestivum)产量的重要病害，挖掘广谱有效的抗病基因有利于促进小麦品种改良。NPR(Nonexpressor of pathogenesis-related genes,NPR)是一类具有广谱抗病作用的关键因子，本研究分析了TaNPR1在抵抗叶锈菌过程中的功能。通过qRT-PCR(quantitative Real-time-Polymerase Chain Reaction)检测，亚细胞定位观察，VIGS技术沉默TaNPR1后试验，表明TaNPR1影响寄主HR(Hypersensitive reaction)的产生，在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中发挥正调控作用。     

影响Ca~(2+)代谢和钙通道的药物对小麦受叶锈菌侵染后诱发的HR的作用

为进一步探讨小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应的信号转导机制,利用小麦品种洛夫林10和不同叶锈菌生理小种组成亲和与不亲和组合,研究影响Ca2+代谢和钙通道的药物对小麦受叶锈菌侵染后诱发的HR的作用。结果表明:在接种前给小麦叶片分别预注射Ca2+螯合剂(EGTA)和Ca2+通道抑制剂(LaCl3和Verapamil),均可使寄主叶片发生过敏性反应(HR)的面积明显减少,并且随着注射药物浓度的增高,寄主细胞发生HR的面积逐渐减小;在只注射Ca2+释放剂(A23187)而不接种的试验中,寄主细胞也发生HR,且HR面积随A23187浓度增加而有所增加,但并不成正比。证明胞内Ca2+浓度升高可能是诱发小麦叶片发生HR所必需的,Ca2+在小麦抵抗叶锈菌侵染的信号传导途径中可能发挥重要作用。     

小麦转录因子基因TabZIP20的克隆及其在小麦-条锈菌互作中的表达

bZIP转录因子已经在多种植物中被报道广泛参与抗病,但是对于bZIP转录因子在小麦与条锈菌互作过程中的抗病机制的研究很少。因此,通过电子克隆及RT PCR方法从条锈诱导的小麦水源11中克隆得到一个具有1 005 bp完整ORF,编码334个氨基酸,且具有bZIP保守结构域的小麦TabZIP转录因子基因。将该基因和拟南芥的基因组比对发现其和 AtbZIP20相似度最高,故命名该基因为TabZIP20。通过转化洋葱表皮细胞发现该基因编码的蛋白定位于细胞核;利用实时定量PCR分析了该基因在小麦与条锈菌亲和与非亲和组合中的表达情况,结果表明该基因在小麦对条锈菌的抗病反应中受条锈菌诱导表达。可见,TabZIP20参与小麦对条锈病的抗病反应,但具体作用机制仍待研究。     

利用农杆菌介导法快速鉴定小麦病程相关蛋白基因TaPR1的功能

本研究拟采用农杆菌瞬时表达体系,在小麦叶片中快速表达目的基因,以鉴定其在小麦抗叶锈病防御反应中的功能。在前期研究基础上,将已克隆获得的小麦病程相关蛋白基因TaPR1构建到小麦过表达载体pLGY-02,转化农杆菌菌株GV3101。然后以感病小麦品种‘金禾9123’为试材,将携带pLGY-02-TaPR1重组质粒的农杆菌GV3101注射到小麦叶片中,以空载体pLGY-02为对照。3 d后接种叶锈菌,14 d后观察小麦叶片表型。同时,在接菌后24、36、48 h时分别采集小麦叶片材料,利用DAB组织化学染色法,监测接种叶锈菌后叶片中H_2O_2的变化,并通过组织病理学显微观察,快速验证TaPR1在小麦与锈菌互作过程中的功能。结果发现,注射重组质粒pLGY-02-TaPR1的叶片发病程度、叶片孢子堆数均轻于、少于对照组叶片,且发病滞后;DAB组织化学染色结果表明,TaPR1表达量增加使得H_2O_2的清除在一定程度上受到抑制,小麦叶片中H_2O_2的分布与积累量均显著多于对照组叶片,说明TaPR1对小麦叶锈菌的致病性具有抑制作用,即TaPR1基因参与了小麦抗叶锈病防御反应。本研究成功构建了能在小麦中瞬时表达的重组载体pLGY-02-TaPR1,并建立了农杆菌介导的在小麦叶片细胞中高效表达外源基因的转化体系,为利用瞬时表达法验证小麦抗性基因功能奠定了基础。