小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库构建及表达序列标签分析

【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签（EST）进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106 pfu•ml-1,扩增文库滴度2×109 pfu•ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3 kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及 加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高,信息丰富,获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%,抗病与防御相关约占17.1%,这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制,为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列（Unigene）,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

小麦与条锈菌亲和互作的差减文库构建及初步分析

 【目的】构建小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离条锈菌侵染小麦过程中的差异表达基因。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌相应毒性小种CY31号为材料,构建条锈菌侵染阶段的SSH-cDNA文库,挑选250个阳性克隆测序并进行生物信息学分析。【结果】聚类后得到149条非冗余EST（unigene）。经Blast X比对和功能分类分析,其中50条unigene（33.6%）未找到同源性匹配,25条（16.8%）与未知功能蛋白同源性较高;其余74条功能已知的unigene中,与初级代谢、能量相关的基因分别有13条和10个,占8.7%和6.7%,感病及防御相关的基因有6个约占4.0%;此外,获得两个与病原菌有较高同源性的基因。随后,进一步利用RT-PCR对6个基因的表达模式进行了分析。【结论】成功构建了小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离出一部分与小麦条锈病发病相关的基因,可用于进一步研究条锈菌侵染过程中特异基因的功能。     

条锈菌诱导的小麦TaOZR的克隆及特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中差异不显著,在非亲和互作中诱导表达;外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸、茉莉酸均诱导TaOZR的积累并上调表达;低温、干旱、高盐非生物胁迫下TaOZR表达差异不显著。【结论】首次克隆到一个条锈菌诱导的小麦TaOZR,TaOZR可能通过水杨酸、乙烯、脱落酸和茉莉酸信号途径协同参与小麦对条锈菌的早期防御。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长cDNA文库构建及其EST注释与比较分析

 【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。     

小麦过氧化物还原酶基因TaPrx的克隆与功能初步分析

 【目的】克隆TaPrx基因并对其在小麦与条锈菌互作中的功能进行初步分析。【方法】利用PCR方法结合RACE技术在cDNA文库中筛选得到TaPrx基因的全长序列并进行生物信息学分析,然后克隆至pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达。通过Real-time RT-PCR进行表达模式分析。【结果】得到TaPrx基因的全长序列688 bp,ORF489 bp,编码162个氨基酸残基,分子量17.36 kD,等电点5.32,含一个保守的半胱氨酸残基（Cys）,不含信号肽及跨膜结构域,亚细胞定位94%的可能性在细胞质。TaPrx融合蛋白分子量38 kD,最佳IPTG诱导浓度0.05 mmol?L-1,20℃诱导20 h可得到最大量的融合蛋白。Real-time RT-PCR分析表明TaPrx基因在小麦与条锈菌的亲和与非亲和互作中均受诱导表达,分别在接种后24 h、18 h达到表达高峰。【结论】获得了TaPrx基因特异性的多克隆抗体;TaPrx基因受条锈菌诱导表达,可能参与了小麦与条锈菌互作。但是否参与了小麦受条锈菌侵染后产生的ROS的清除与调节仍需进一步验证。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

西瓜与枯萎病菌非亲和互作的表达序列标签分析

目的从整体水平上阐明西瓜与枯萎病菌非亲和互作基因表达的特征。方法用SSH方法构建枯萎病菌接种处理后不同时间点的cDNA文库,对其中获得3895条高质量的表达序列标签(EST)序列进行分析。结果在测定4431条cDNA序列中,序列拼接后获得1756条unigene,经过注释和分析,发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因,及茉莉酸和木质素生物合成途径等。结论在西瓜与枯萎病菌互作的SSH-cDNA文库中,与抗病防御相关基因约占36.3%,初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中基因表达信息,这些基因的发现为在分子水平上研究西瓜与枯萎病菌的互作机制以及相关重要基因的克隆与功能分析奠定基础。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白,了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽,编码定位于液泡的碱性蛋白,蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性,与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近,与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异,总体上,该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达,该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加,并在接菌后48 h达到表达高峰;而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达;在茎中接菌后48 h开始有少量表达,但表达量变化不大,趋于平缓,总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期,除1叶期外,该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达,Mock（未接菌处理）反应中,TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势;接种叶锈菌后,TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应,且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）均能诱导该基因的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导,TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路,并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

小麦抗叶锈病基因Lr24的TRAP分析

 【目的】获得与Lr24基因紧密连锁并可能作为探针的TRAP分子标记。【方法】应用TRAP技术,选用90对引物组合对小麦抗叶锈病基因Lr24、感病亲本Thatcher及其F2代抗感各10株组成的抗、感基因池（Br、Bs）的扩增带型差异进行分析,用筛选获得的多态性引物对TcLr24×Thatcher F2群体进一步筛选,进而用获得的特异引物对45个小麦抗叶锈病近等基因系和30个小麦二倍体材料进行分析。【结果】获得10对能够在TcLr24、Br与Thatcher、Bs间产生多态性的引物,多态性引物检出率为11.11%。其中1对在F2抗感群体中有差异且稳定扩增的TRAP引物ARBI1/RGA-2F,其161bp 扩增产物仅在F2抗病单株中出现,感病单株中缺失。用该引物对45个近等基因系和30个二倍体材料检测发现,近等基因系TcLr19、TcLr29、TcLr38、Lr42和TcLr44中有相同大小片段的扩增产物,30个二倍体材料中未出现相应扩增产物。【结论】本研究获得的一个与Lr24紧密连锁的TRAP标记,该标记可筛选含有Lr24基因的育种后代群体,可作为探针用于文库的筛选。     

小麦类受体蛋白基因TaRLP19 cDNA序列克隆及分析

为筛选小麦叶锈病抗病相关基因,以从小麦近等基因系TcLr19中获得的特异表达的168 bp cDNA-AFLP片段为靶序列,通过cDNA末端快速扩增(RACE)的方法获得2545 bp的cDNA序列,并在接菌的TcLr19叶片中进行RT-PCR验证,测序结果与RACE结果一致.tBLASTn比对发现该序列与预测的二穗短柄草的Receptor-like protein 2-like (LOC100825532)有67％的一致性(Expect=0.0).该基因包含一个2136 bp的开放阅读框,编码711个氨基酸;SMART分析表明其含有6个LRR结构域,属LRR-TM类型,推测其为假定的富含亮氨酸的类受体蛋白基因,暂命名为TaRLP19,GenBank登录号为(JN872563).半定量RT-PCR分析表明,该基因属组成型特异表达类型.为进一步研究叶锈菌与小麦TcLr19非亲和反应中类受体蛋白TaRLP19的功能及其表达调控机制等奠定基础.     

利用cDNA-AFLP技术鉴定菊花品种‘紫荷’的抗白锈病相关基因

【目的】筛选菊花中抗白锈病相关基因,研究菊花抗白锈病的分子机理。【方法】以菊花中对白锈病完全免疫的品种‘紫荷’为供试材料,对其叶片喷施106个白锈病冬孢子/mL蒸馏水,处理时间梯度为0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h,使用cDNA-AFLP技术分析这一接种过程中的差异表达基因,并采用RT-PCR方法对表达结果进行验证。利用RACE技术克隆其中重要蛋白基因的cDNA全长,采用MEGA 4.0程序进行序列分析。【结果】利用76对引物组合,共筛选出了约4 950条差异表达的cDNA片段,对其中80个表达差异显著的片段进行测序,最终得到51个差异片段的核苷酸序列。Blastx同源性比对发现,其中18个序列与已报道的抗病基因具较高同源性,其功能涉及到抗病、信号转导、光合作用和光呼吸、反转录转座子以及植物基础代谢。RT-PCR验证结果表明,利用cDNA-AFLP技术获得了稳定表达的序列;使用RACE技术获得了其中两个编码植物14-3-3蛋白的基因：CmGFR01、CmGFR02的cDNA全长序列分别为1 062 bp和1 098 bp,分别编码含260和271个氨基酸残基的开放阅读框。对序列进行分析发现,CmGFR01、CmGFR02属于高等植物中一类新的14-3-3基因亚家族。【结论】构建了菊花品种‘紫荷’在白锈病胁迫下的基因表达谱,从基因组水平上识别了一批与抗白锈病相关的基因,这些基因有助于解析植物抗白锈病的分子机理。分离得到的CmGFR01、CmGFR02可用于栽培菊花抗白锈病的分子育种。     

异三聚体G蛋白参与小麦抗叶锈病反应的研究

 【目的】研究异三聚体G蛋白是否参与小麦抗叶锈病反应的过程,为更深入地了解小麦抗叶锈病的反应机制奠定基础。【方法】用异三聚体G蛋白的效应剂处理离体培养的小麦叶片后接种叶锈菌观察侵染型的变化。测量经异三聚体G蛋白的效应剂诱导后防卫反应酶活性值,观察变化趋势。另外用半定量RT-PCR方法检测接种毒性菌株和无毒性菌株后异三聚体G蛋白α亚基基因的表达情况。【结果】用激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后明显可以推迟叶片发病,而抑制剂百日咳毒素（PTX）作用不明显。用G蛋白的激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后防卫反应酶的活性升高,而用抑制剂百日咳毒素（PTX）处理后24 h再接种无毒性叶锈菌菌株,防卫反应酶的活性却无明显的变化。无毒性叶锈菌菌株可以诱导叶片中G蛋白基因表达量升高,毒性菌株抑制G蛋白基因的表达。【结论】异三聚体G蛋白可能参与了小麦抗叶锈病的反应过程。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。