小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

小麦条锈菌一个产孢相关基因PsCon1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦条锈菌产孢相关基因PsCon1,分析其在病菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PsCon1的cDNA序列和基因组序列,采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域等基本特性,运用实时荧光定量RT-PCR技术分析PsCon1在夏孢子,芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PsCon1由3个外显子和2个内含子构成,开放阅读框长为252bp,编码83个氨基酸;编码的蛋白PSCON1不含跨膜区,无信号肽,定位在细胞质,具有2个conidiation-specific protein6保守结构域。PsCon1与小麦秆锈菌核苷酸序列的一致性在外显子区为78%,内含子区为43%,与小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的亲缘关系最近,与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和费氏新萨托(Neosartorya fischeri)的亲缘关系次之。PsCon1在小麦条锈菌萌发夏孢子时期基因表达量为新鲜夏孢子中的1.69倍。在亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后6h和24h表达量最高,分别为在新鲜夏孢子中表达量的3.21倍和2.91倍;在接种后24h至168h,基因表达基本呈下调趋势,在接种后168h的表达量最低,仅为夏孢子时期的0.0004倍,在接种后216h和264h,表达量有所增加,表达量约为接种后168h的15倍。在非亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后36h表达量最高,但仅为新鲜夏孢子基因表达量的0.13倍,基因表达总体呈下调趋势。【结论】PsCon1参与了小麦条锈菌对小麦的侵染,可能作为一个致病相关基因影响了条锈菌芽管和吸器的形成,同时促进了条锈菌在侵染过程中的产孢。PsCon1的克隆为进一步研究该基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能奠定了基础。     

芝麻栽培种与野生种（Sesamum schinzianum Asch、Sesamum radiatum Schum & Thonn）种间杂交后代的生物学特性

【目的】探明芝麻栽培种与野生种种间杂交的亲和性,分析杂交后代遗传特征。【方法】以26个基因型（Sesamum indicum L.）与刚果野芝麻（Sesamum schinzianum Asch）和野芝1号（Sesamum radiatum Schum & Thonn）野生种为杂交亲本,借助胚培养技术获得种间杂交后代。采用SSR标记和生物学方法鉴定并分析杂交种F1的遗传特性。【结果】通过胚培养技术获得2 430个种间杂交F1株系,对部分材料的检测表明杂种阳性率为95.83%。刚果野芝麻×栽培种的正反交杂交率分别为34.62%（A）和11.54%（C）,野芝1号×栽培种的正反交杂交率分别为100%（B）和19.23%（D）。F1花粉粒存在部分不育和高度不育两种类型,F1自交结实率分别为2.32—2.57粒/蒴果（S. schinzianum×S. indicum）和0.30—2.45粒/蒴果（S. radiatum ×S. indicum）。【结论】S. radiatum与栽培种的杂交亲和率高于S. schinzianum。以野生种为母本与栽培种杂交,杂交种F1在株高、根系结构等性状方面超亲表现明显;株系高抗枯萎病;部分F1株系有低自交结实性。     

渍害胁迫对芝麻籽粒及制油品质的影响

为了研究渍害胁迫对芝麻籽粒及制油品质的影响,以豫芝11号等6个芝麻品种为材料,在芝麻生长-盛花期时,采用耐渍池分别进行0,36 h的连续淹水处理,成熟后收集芝麻籽粒,并从籽粒的外观、营养组分、矿物质及油制品等方面进行深入的品质分析。结果表明,渍害胁迫处理后,不同品种的芝麻籽粒种皮颜色变深,瘪粒增多,降低了芝麻的商品价值,但不改变芝麻籽粒的长度和宽度,其平均值分别在3.00,1.80 mm左右。渍害胁迫使籽粒中的营养成分粗脂肪、粗蛋白、总糖含量存在不同程度的变化,其变化幅度分别为-3.73%~2.03%,-0.10%~-2.16%,-0.93%~5.80%;同时也导致了粗纤维和灰分含量的增加。胁迫处理使矿物质元素Ca、K、Mg、Na含量存在不同程度的变化。其中Ca元素随着品种不同,不存在规律一致的变化。但是K、Mg、Na含量均呈升高趋势。芝麻油制品的变化则主要表现在酸值和过氧化值基本呈升高趋势(品种M5的过氧化值例外),油酸、亚油酸和棕榈酸含量无显著性变化,花生酸、亚麻酸、棕榈油酸含量存在一定变化,微量成分芝麻素、芝麻林素含量的变化因品种而异。     

芝麻EMS诱变条件优化与突变体筛选

为明确适于芝麻诱变的最佳甲基磺酸乙酯(EMS)剂量和处理时间,创制优异芝麻突变体,采用0.1%~2.0%EMS浸泡处理芝麻91-0株系种子6~24 h,研究了EMS不同剂量和处理时间对芝麻突变体创制效率的影响。结果显示,0.1%EMS浸种24 h、0.5%EMS浸种24 h、1.0%EMS浸种12 h、1.5%EMS浸种6 h处理芝麻种子发芽势、发芽率为53.13%~90.17%,根长为0.30~2.00 cm,活力指数为18.53~131.00,适于芝麻诱变研究。2008—2010年,选用1.0%EMS浸种12 h优化条件先后处理芝麻91-0株系成熟种子7万粒,共获得M1代植株22 855份,成株率达到32.65%。对诱变株系及其后代叶型、株型、花器与育性、蒴果及粒型以及其他共5类24个田间农艺性状的调查结果表明,M1、M2代诱变率分别为7.60%、2.78%,M1、M2代株系发生的主要突变性状类型均为花器与育性类,比率分别为4.08%、0.93%。对831份突变体后代株系的农艺性状调查结果显示,后代中可稳定遗传的突变体比率为23.71%,主要突变类型为蒴果及粒型,占总调查株系的14.80%。研究表明,在1.0%EMS浸泡12 h诱变处理条件下,芝麻91-0株系发生可遗传突变的比率为0.80%。     

芝麻枯萎病菌毒素成分分析及其对芝麻幼苗的毒性

芝麻枯萎病(sesame Fusarium wilt,SFW)是由尖孢镰刀菌芝麻专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.sesami(Zap.),FOS]引起的一种土传真菌病害,严重影响着我国芝麻生产。为确定FOS是否产生毒素以及毒素成分,利用液相色谱和液质联用等技术分离并分析了FOS菌株培养滤液的主要组成物质。研究发现FOS能够产生4种特异物质,分别为镰刀菌酸(5-丁基吡啶甲酸,FA),及C_(10)H_(13)NO_4(FA+O_2)、C_(10)H_(13)NO_3(FA+O)和C_(10)H_(11)NO_2(FA-H_2)_3种镰刀菌酸类似物。在Richard培养基上强致病力和弱致病力FOS菌株均可获得毒素,不同致病力的菌株所产生4种物质的含量和比例存在差异。芝麻幼苗生长试验结果证明含有上述特异物质的FOS培养滤液能够对幼苗生长产生抑制作用;而随着FOS毒素浓度的增大,芝麻幼苗受毒害程度增大。但在含相同FA浓度的FOS培养滤液处理下,不同芝麻品种幼苗生长受抑制程度无显著差异。该结果为进一步研究FOS致病机理及芝麻-FOS互作奠定了技术和理论基础。     

小麦过氧化物还原酶基因TaPrx的克隆与功能初步分析

 【目的】克隆TaPrx基因并对其在小麦与条锈菌互作中的功能进行初步分析。【方法】利用PCR方法结合RACE技术在cDNA文库中筛选得到TaPrx基因的全长序列并进行生物信息学分析,然后克隆至pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达。通过Real-time RT-PCR进行表达模式分析。【结果】得到TaPrx基因的全长序列688 bp,ORF489 bp,编码162个氨基酸残基,分子量17.36 kD,等电点5.32,含一个保守的半胱氨酸残基（Cys）,不含信号肽及跨膜结构域,亚细胞定位94%的可能性在细胞质。TaPrx融合蛋白分子量38 kD,最佳IPTG诱导浓度0.05 mmol?L-1,20℃诱导20 h可得到最大量的融合蛋白。Real-time RT-PCR分析表明TaPrx基因在小麦与条锈菌的亲和与非亲和互作中均受诱导表达,分别在接种后24 h、18 h达到表达高峰。【结论】获得了TaPrx基因特异性的多克隆抗体;TaPrx基因受条锈菌诱导表达,可能参与了小麦与条锈菌互作。但是否参与了小麦受条锈菌侵染后产生的ROS的清除与调节仍需进一步验证。     

适于微量芝麻样品酸价测定的铜皂比色法的建立与评价

为快捷、准确地测定微量芝麻样品的酸价，选用13份芝麻油脂和20份芝麻籽粒样品，开展了铜皂染色液配方改良及铜皂反应显色强度分析，首次建立了适于微量芝麻样品酸价测定的铜皂比色方法。结果显示，建立的铜皂比色法测定芝麻样品酸价的最佳测定波长为710 nm；单次样品测定芝麻油脂最低用量为60 mg，芝麻籽粒样品平均用量为0.11 g。在0.1～10 mg/mL油酸下，铜皂比色法标准工作曲线方程为y=0.199x+0.017 2(R²=0.999 7)；铜皂比色法可检测芝麻样品的酸价为0.18～17.50 mg/g。测定结果显示，室温久置的13份芝麻油脂样品以及20份芝麻籽粒样品酸价分别为1.36～6.32 mg/g和1.02～5.03mg/g。铜皂比色法测定方法相比于标准酸碱滴定法，精密度和准确度均较高，二者结果差异不显著，因此可用铜皂比色法代替酸碱滴定法进行芝麻籽粒和芝麻油脂酸价测定。另外，检测发现，测定时间对样品酸价测定值也有一定的影响，配制好铜皂络合物后应尽快用于检测。     

芝麻种间杂交亲和性差异及杂种生物学特征分析

【目的】 探索芝麻不同种之间的杂交亲和性,分析其杂种的生物学特征,为芝麻野生种种质资源高效利用提供依据。【方法】 以芝麻栽培种豫芝11号（S. indicum,2n=26）和S. latifolium（2n=32）、S. calycinum（2n=32）、S. angustifolium（2n=32）、S. radiatum（2n=64）等4个野生种为亲本材料,采用双列杂交方法,通过田间人工授粉配置不同种间组合;结合胚拯救方法获得种间杂种F₁。根据杂交结蒴率比较组合杂交亲和性;在盛花期和成熟期观察杂种植物学性状特征,利用Alexander染色法进行花粉粒育性鉴定。通过根尖细胞染色体涂片明确杂种染色体数目及特征。选用自主筛选的胡麻属特异多态性SSR引物,分析种间杂种分子标记差异。【结果】 配置了5个芝麻种间的20个正、反交组合,共授粉2 091朵花,获得杂交蒴果370个。发现以染色体数目多的种为母本更易获得远缘杂交蒴果。5个芝麻种之间杂交亲和性的变化范围为1.18%（S. radiatum×S. calycinum）—63.33%（S. calycinum×S. angustifolium）。共有9个杂交组合获得杂种F₁种子,F₁植株的花粉败育率为35.21%—100.00%,其中,S. calycinum与S. angustifolium杂交组合F₁的可育株比例最高,为87.68%。杂种F₁在株高、株型等性状方面均表现出明显的超亲优势。栽培种与各野生种的正反交杂种F₁在叶型、花型和花色表现出双亲的局部特征。栽培种芝麻（n=13）与具有n=16染色体组型的3个野生种的杂交亲和性依次为S. angustifolium>S. calycinum>S. latifolium;野生种S. radiatum（n=32）与n=16染色体组的3个野生种的亲和性依次为S. calycinum>S. angustifolium>S. latifolium。在5个种中,野生种S. calycinum与S. angustifolium的亲缘关系相对最近。获得的部分杂种植株根尖细胞染色体数目观察显示,杂种的染色体数目与理论值一致。利用3对多态性SSR引物对F₁植株的分子鉴定结果显示,真杂种比例为99.66%。杂种染色体核型和特异SSR标记结果显示出胡麻属不同种的遗传特征差异。【结论】 胡麻属5个种之间的杂交亲和性差异显著,种间杂交后代杂种优势明显;S. calycinum与S. angustifolium的亲缘关系相对最近,可用于芝麻优异种质创制和远缘杂交育种研究;其他种间杂交存在着生殖隔离障碍,可采用胚拯救、分子标记利用等手段加强芝麻野生资源利用。