猪流行性腹泻病毒3种抗原卵黄抗体的制备

【目的】探讨猪流行性腹泻病毒(PEDV)3种不同抗原制备的卵黄抗体对PEDV的中和能力,为抗猪流行性腹泻卵黄抗体的制备提供新的方法和理论基础。【方法】根据PEDV S糖蛋白基因设计引物扩增PEDVS534基因(636~789位氨基酸)和PEDV COE基因(499~638位氨基酸),并构建原核表达质粒pET32a-PEDV S534和pET32a-COE,分别转化表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达。以原核表达的PEDV S534蛋白、COE蛋白以及PEDV灭活病毒为抗原,分别免疫产蛋鸡并制备卵黄抗体,通过病毒中和试验评价各卵黄抗体的中和效力。【结果】成功表达了PEDV S534蛋白和COE蛋白,Western-Blotting分析显示,2种蛋白均具有很好的免疫原性;制备的3种特异性卵黄抗体均具有一定的病毒中和能力,PEDV S534蛋白特异性卵黄抗体的中和效价为1∶12,COE蛋白特异性卵黄抗体的中和效价为1∶25,而PEDV灭活病毒的卵黄抗体中和效价达到1∶120。【结论】PEDV灭活病毒的中和能力最强,其次为COE蛋白特异性卵黄抗体,PEDV S534卵黄抗体的中和能力较弱。     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的单克隆抗体(Mab),以原核表达的融合蛋白GST-N为免疫原,免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,利用重组蛋白His-N和Vero细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得3株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(5B2,3H1和4H5),单抗亚型鉴定均为Ig G1,轻链均为Kappa链。Western blot和间接免疫荧光试验结果表明,Mab能够识别重组N蛋白和PEDV。制备获得3株稳定性好、特异性强的Mab,可为今后建立检测猪流行性腹泻特异性诊断方法和研究PEDV核衣壳蛋白功能奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立快速准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法。【方法】以原核表达的PEDV S蛋白为包被抗原,建立高效特异的间接ELISA抗体检测方法。PCR扩增PEDV S基因并命名为SJ,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-32a (+)-SJ。重组蛋白经诱导表达、纯化鉴定后,测定蛋白质量浓度,以其为抗原包被于板。优化ELISA反应条件,对建立方法的特异性、重复性、符合性及临床应用进行评估。【结果】原核表达的PEDV S蛋白约为35 ku,质量浓度为1.145 mg/mL。Western-blot鉴定其具有良好的反应原性,以其作为包被抗原建立的PEDV间接ELISA抗体检测方法仅对PEDV血清检测为阳性,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于6%,利用该方法对临床样品检测的结果与市售检测结果符合率为96.67%。【结论】该方法特异性良好,重复性高,成本低,可用于临床PEDV血清抗体检测以及PEDV流行病学的监测,对本病的预防具有重要意义。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体(MAb),本试验将Vero细胞中增殖的PEDV超速离心纯化,作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术和PEDV重组S蛋白为基础的间接ELISA方法,制备并筛选能稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞;分别采用间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验,对单克隆抗体的亚型、特异性等生物学特性进行鉴定。结果表明,本试验成功获得了1株稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞株5C3。MAb亚类鉴定为IgM,轻链为k型。杂交瘤细胞连续传至20代,细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价分别稳定在1∶600和1∶10 000。特异性试验结果显示,MAb不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪圆环病毒(PCV2)发生交叉反应。western-blot结果显示,MAb能特异性识别PEDV的重组S蛋白。IFA试验结果表明,MAb能与PEDV感染的vero细胞产生特异性荧光。说明本试验获得的MAb能特异性识别重组及天然的PEDV S蛋白,具有良好的抗原性和特异性。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

抗重组猪三十九肽胆囊收缩素卵黄抗体的制备

制备重组猪三十九肽胆囊收缩素(GST-CCK39),以其为抗原免疫28周龄的蛋鸡,用水稀释脱脂处理,聚乙二醇(PEG)一步法制备高效价卵黄抗体,并用免疫琼脂扩散试验、ELISA、Dot-ELISA检测其效价及特异性。结果表明,免疫琼脂扩散测得特异性抗体效价达1∶16以上,ELISA效价达1∶12 800以上;Dot-ELISA显示所获得卵黄抗体具有较强的特异性;高效价,特异性的卵黄抗体可维持50 d以上。表明用重组蛋白GST-CCK39免疫蛋鸡后能获得效价高、特异性强的卵黄抗体。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株COE基因的原核表达及免疫原性分析

应用RT-PCR方法从PEDV流行毒株中扩增COE基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建pET-32a-COE重组质粒。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,该重组蛋白获得了表达,主要以包涵体形式存在,分子量约为35.5 ku;Western-blot分析结果显示,所表达的重组蛋白能与抗PEDV小鼠血清反应。应用纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂免疫6周龄BALB/C小鼠并采集血清,ELISA检测抗体效价达1∶3 200以上,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。     

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5的原核表达及特性分析

通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以乳化灭活的猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为抗原,免疫大白兔,制备兔抗PEDV高免血清,纯化抗PEDV IgG并进行生物素标记。以体外表达的PEDV S蛋白作为抗原,商品化的PEDV单克隆抗体作为捕获抗体,生物素标记的IgG作为检测抗体,建立了检测PEDV的生物素-亲和素系统的双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法最低检测限量为20 ng/μL,且稳定性和特异性较好。对25份临床猪腹泻样品进行检测,3份检出PEDV阳性,与RT-PCR法的符合率为100%。本研究为PEDV临床检测提供了新方法,也为猪腹泻病原的多重检测技术研究奠定了基础。     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白截短表达及多抗制备

文章旨在表达猪流行性腹泻病毒PEDV截短S1基因(rS1636-789),并制备特异性多克隆抗体。扩增PEDV rS1636-789基因克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上,构建重组表达质粒PGEX-6P-1-rS1636-789,经IPTG诱导,获得以包含体形式表达重组蛋白。将重组蛋白作为免疫原制备兔抗rS1636-789抗体并进行效价测定及生物活性检测。结果表明,多抗效价达1:65 536,间接ELISA和Western blot说明此多抗可与rS1636-789重组蛋白发生很好抗原抗体反应。研究进一步定位PEDV S蛋白免疫优势区,为PEDV基因工程疫苗研究奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的研制

选取猪流行性腹泻病毒感染组织制备灭活苗,免疫蛋鸡制备卵黄抗体,3次免疫后琼扩抗体效价达到1:32;经动物实验证实,卵黄抗体可有效抵抗猪流行性腹泻病毒强毒的攻击,试验为猪流行性腹泻病毒的有效防控奠定基础。     

PCV2 Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及蛋白免疫印迹试验验证,重组蛋白主要以可溶性形式表达,少数为包涵体蛋白。以Ni-NTA树脂进行蛋白纯化,纯化后蛋白浓度为629μg·mL^-1,采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩,浓缩后蛋白终浓度为1.8 mg·mL^-1。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后制备抗原,免疫兔子采集全血,分离血清。经蛋白免疫印迹试验,该多抗与重组蛋白存在免疫反应性,ELISA检测抗体效价可达1∶32 000,IFA试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒2型。Cap蛋白多克隆抗体的成功制备,为后续猪圆环病毒2型基因工程疫苗制备过程中验证Cap体外蛋白表达提供了材料。     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性SIgA抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化，采用纯化的病毒作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体，通过优化检测条件，建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒SIgA抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔^-1，样本最佳稀释比例为1∶5，作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100，作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV SIgA抗体，与PoRV(Porcine rotavirus, PoRV)、 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应；批内、批间重复试验的变异系数小于10%，具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发...     

PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。     

塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64 000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及特性分析

为制备猪流行性腹泻病毒(PDEV)的单克隆抗体,并鉴定单克隆抗体特性。本试验采用差速和蔗糖梯度离心纯化PEDV抗原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经ELISA方法筛选和细胞克隆,得到能分泌鼠抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出相应的单克隆抗体,并分析其特性。试验结果:获得2株能稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体,命名为E1和H6株,其中E1单隆抗体为IgG2a亚型,H6单隆抗体为IgM亚型,2株单克隆抗体均具有IFA、ELISA和Western bloting特性。E1杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别26和105,H6杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别24和104。2株单克隆抗体与Vero细胞、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均无交叉反应。Western bloting测定结果表明,E1株单克隆抗体能识别PEDV的M蛋白,H6单克隆抗体能识别PEDV的N蛋白。PEDV单克隆抗体的成功研制,为PEDV免疫诊断、表位识别及蛋白研究奠定了良好基础。