烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析

[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析。[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况。[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达。[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据。     

利用GFP标记对OsWAK1蛋白胞外区的鉴定

水稻OsWAK1编码一细胞壁相联的受体类似蛋白激酶,对其推断的氨基酸进行预测,其结构组成包括胞外区、跨膜区和胞内激酶区。推断OsWAK1蛋白胞外区与配体识别并结合,是胞外信号传递到胞内的信号转导途径中的重要环节,因此OsWAK1蛋白的胞外区是OsWAK1发挥其生物学功能所必需的。将预测的OsWAK1蛋白胞外区与GFP构建为融合蛋白,通过融合蛋白在烟草细胞中的定位确定OsWAK1蛋白结构上含有预测的胞外区。     

苎麻生长素结合蛋白BnABP1与GFP融合在烟草中的表达

运用已克隆的苎麻生长素结合蛋白BnABP1基因cDNA及植物表达载体pCAMBIA1300 GFP,构建了35S启动子控制的苎麻BnABP1基因编码区段与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达重组体(pCAMBIA1300 GFP BnABP1)。通过根癌农杆菌介导法将其转化烟草WS38,经抗性筛选和PCR检测获得了转基因烟草。对转基因烟草细胞进行荧光显微镜观察,发现在细胞质膜和内膜系统上都有较强烈的荧光信号,进一步证明苎麻生长素结合蛋白ABP1已结合在细胞的膜系统上。     

辣椒水通道蛋白基因CaTIP1-1启动子的克隆及序列分析

利用巢式PCR技术分离获得CaTIP1-1基因上游1749 bp的片段.利用PlantCARE软件预测发现该序列含有启动子典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及非生物胁迫相关的元件和光应答元件.以PBI121载体为基础,构建CaTIP1-1启动子驱动下绿色荧光蛋白GFP报告基因植物表达载体.利用叶盘法转化烟草获得转基因植株,通过荧光显微镜能够检测到T1代烟草悬浮细胞系能够稳定表达荧光.结果表明该启动子具有驱动绿色荧光蛋白表达的活性.该研究为今后CaTIP1-1启动子在植物基因工程育种中的应用奠定基础.     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位分析

为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。     

农杆菌渗透法转化烟草条件的优化

植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作,将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105,获得工程菌,制备不同浓度的农杆菌浸染液,用注射法对烟草叶片进行转化,荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP的表达情况。结果表明,浸染注射液的D600 nm在0.3~0.7之间均具有较高的转化效率,注射后第4天至第6天为较佳观察时间。     

辣椒水通道蛋白基因CaTIP1-1启动子的克隆及序列分析（英文）

利用巢式PCR技术分离获得CaTIP1-1基因上游1749 bp的片段。利用PlantCARE软件预测发现该序列含有启动子典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及非生物胁迫相关的元件和光应答元件。以PBI121载体为基础,构建CaTIP1-1启动子驱动下绿色荧光蛋白GFP报告基因植物表达载体。利用叶盘法转化烟草获得转基因植株,通过荧光显微镜能够检测到T1代烟草悬浮细胞系能够稳定表达荧光。结果表明该启动子具有驱动绿色荧光蛋白表达的活性。该研究为今后CaTIP1-1启动子在植物基因工程育种中的应用奠定基础。     

烟草谷氧还蛋白NbGRX1的亚细胞定位及抗旱功能研究

[目的]本文旨在分析烟草NbGRX1基因的亚细胞定位及抗旱功能。[方法]在前期研究中,我们从烟草中克隆了1个谷氧还蛋白基因NbGRX1,并对其表达特性进行了研究。在此基础上,对NbGRX1蛋白的亚细胞定位及抗旱功能进行研究。利用病毒介导的基因沉默,在烟草中沉默了该基因,并调查NbGRX1基因沉默后烟草对干旱的响应。同时采用农杆菌介导法,将NbGRX1基因转化至拟南芥中,筛选单拷贝插入的纯合转基因拟南芥进行后续研究,对转基因拟南芥及对照进行干旱处理,并分析其表型。[结果]亚细胞定位研究表明,空载体中的GFP(绿色荧光蛋白)定位在细胞质和细胞核中,GFP:NbGRX1的融合蛋白均匀分布在细胞质和细胞核中,因此可以推测NbGRX1蛋白能定位在植物的细胞核和细胞质中。病毒介导的基因沉默研究表明,NbGRX1基因沉默烟草与对照相比对干旱胁迫更为敏感,更容易出现黄化和萎蔫的症状,叶片相对含水量下降;NbGRX1基因超量表达的株系干旱能力明显高于对照。[结论]烟草NbGRX1基因能够提高植物的抗旱性。     

核糖体失活蛋白(α-MC)亚细胞定位及对TMV的抑制作用

【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。     

生长素结合蛋白与纤维素合成酶在同一细胞中的标记与定位

生长素通过其结合蛋白(ABP1)促进细胞纤维素合成并使细胞伸长生长。为探明ABP1与纤维素合成酶(CesA1)这2种蛋白质之间的相互关系,分别对这2种蛋白质进行了荧光标记,构建了绿色荧光蛋白(GFP)对ABP1融合标记以及青色荧光蛋白(CFP)对CesA1融合标记的2种载体。采用烟草叶片侵注法,将2种重组体转入烟草叶片同一细胞进行瞬时表达。扫描激光共聚焦显微成像观察到转基因瞬时表达的烟草铺列细胞的细胞膜上有强烈两色荧光信号,表明这2种蛋白集中在细胞膜上分布,其分布区域存在明显的重叠。在细胞的内膜系统中绿色荧光信号相对较强,青色荧光信号较弱,表明内膜系统中也分布着一定量的ABP1,而纤维素合成酶在内膜系统中不会集中分布。在叶片铺列细胞间嵌合交错区可以观察到青色荧光的高亮点,表明此处存在纤维素合成酶的高密度分布,也说明在此部位有更多的纤维素合成。     

烟草丛顶病毒编码的沉默抑制子初步鉴定

 烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）为幽影病毒属成员,能在烟草上造成严重危害。TBTV基因组编码4个ORF,其中ORF3和ORF4几乎完全重叠,可能在TBTV的致病性中发挥重要作用。分别将TBTV的ORF3和ORF4与载体pGR107连接,构建植物表达载体pGR107 ORF3,pGR107 ORF4。经农杆菌与含外源GFP基因的pGREEN208共浸润转GFP基因的本氏烟16c叶片,2～5d后（days post inoculation,dpi)在紫外灯下观察发现浸润区有明显绿色荧光,其中pGR107 ORF4在12dpi后浸润区绿色荧光区域扩大,推断ORF4编码产物可能具有局部抑制本氏烟16c对外源GFP基因进行沉默的功能;而pGR107 ORF3浸润区绿色荧光逐渐恢复红色,GFP基因发生沉默,说明ORF3编码产物不具有抑制基因沉默的功能。进一步利用real time PCR定量检测发现,pGR107 ORF4浸润15 dpi 的本氏烟叶片中GFP RNA的含量要比仅接种pGR107的对照高,比未接种的本氏烟16c稍低。推断是因为ORF4编码蛋白抑制了植物对外源GFP RNA产生的沉默,使GFP得以在本氏烟内表达。由此进一步证实ORF4编码产物是TBTV的基因沉默抑制子。     

Disease resistance: incorporation into sexually incompatible somatic hybrids of the genus Nicotiana

Somatic hybrid plants of Nicotiana nesophila and N. stocktonii with N. tabacum (cultivated tobacco) were produced by protoplast fusion. These combinations cannot be achieved with conventional sexual hybridization, yet are important in that the wild Nicotiana species are resistant to numerous diseases. Hybridity was verified by chromosome number, isoenzyme analysis, morphological characteristics, and genetic behavior. Local lesion-type resistance to tobacco mosaic virus has been observed in leaves of these somatic hybrid plants.     

壳寡糖类物质对烟草TMV的抑制及防御酶系的影响

在接种烟草花叶病毒(TMV)前几天,用自制的壳寡糖溶液处理心叶烟(Nicotiana glutinosa)和烟草品种NC89(Nicotiana tobaccumcvNC89),测定其在烟草上对TMV的抑制作用及引起的寄主体内防御酶系变化。结果表明:壳寡糖处理后,在心叶烟上对TMV的病斑抑制率在第10天达最高,为79.10%;在烟草品种NC89上对TMV的防效在第10天达最高,为32.41%。同时,壳寡糖处理可导致烟草品种NC89叶片的PAL、POD、PPO、SOD活性不同程度提高,可溶性蛋白含量增加。表明壳寡糖类物质可以诱导烟草对TMV的抗性,提高烟草的免疫能力。     

烤烟新品种湘烟2号的选育及其特征特性

湘烟2号(原HC9511)系选用中烟90为母本、云烟315为父本,通过杂交获得的烤烟杂交新组合,2009年6月通过全国烟草品种审定委员会审定.湘烟2号株型筒型,叶形椭圆形,叶脉较细到中等,茎叶角度适中,田间生长势强,前期早生快发,性状稳定,分层落黄明显,耐成熟,易烘烤.并且抗黑胫病,中抗青枯病,中感赤星病、普通花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、马铃薯Y病毒病、根结线虫病,适合我国东南烟区种植.湘烟2号抗病性、外观质量、化学成分与对照品种K326相当,经济性状和感官质量优于K326.     

漂盘培养液中TMV含量对烟草花叶病发病情况的影响

[目的]为提高烟叶产量和品质提供参考。[方法]以普通烟K326和心叶烟为材料,用12．7、1．27、0．127、0．0127μg/ml烟草花叶病毒（TMV）液对K326进行漂盘培养,培养5、10、15、20、25d后随机取各处理K326叶片得叶片提取液,用各处理提取液接种8叶期心叶烟叶片,调查K326的发病情况及心叶烟的枯斑数。[结果]12．7ug／mlTMV处理K326表现出发病症状,其他处理未表现明显发病症状;随着培养液中TMV浓度的升高,各处理烟叶提取液接种心叶烟产生的枯斑数逐渐增多,且枯斑数随病毒接种时间的延长迅速增加;12．7、1．27μg/mlTMV处理K326叶片提取液接种20d后心叶烟枯斑数最多,0．127、0．0127μg／mlTMV处理K326叶片提取液接种25d后心叶烟枯斑数最多。[结论]烟草花叶病的发病率和病情指数与培养液中TMV的浓度有关。     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4非编码区启动子活性的研究

应用PCR方法亚克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物 (BananabunchytopvirusChineseZhangzhouisolate ,BBTV ZZ)DNA 4非编码区 (Po1)、主要共同区缺失片段 (Po2 )和主要共同区及茎环共同区都缺失片段 (Po3) ,分别插入到植物表达载体pCAMBIA 130 4的gfp::gus基因上游 ,替代椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S) ,得到重组质粒pTA2、pC2 6和pC45 .通过Agroinfiltration法 ,将含pTA2、pC2 6、pC45和pCAMBIA 130 4的根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtu mefaciens)注射进烟草 (NicotianatabacumL .cv .XanthiNC)叶片 ,进行 β 葡糖苷酸酶 (GUS)和绿荧光蛋白 (GFP)含量的瞬间表达分析 .含有pTA2、pC2 6、pC45、pCAMBIA 130 4和未注射的烟草叶片其GUS活性分别为 1 0 0 7、0 85 2、0 939、2 0 6 9和 0 0 2 1pmol·MU (μg·min) ;间接酶连免疫试验 (ELISA)结果表明每毫克总蛋白中的GFP于 490处的吸收值 (A490 )分别为 89 5 77、6 5 184、72 0 96、10 0 4 40和 3 2 87.以上表明Po1、Po2和Po3具有较强的启动子活性 .此外 ,转基因烟草的GUS组织化学定位检测试验进一步表明Po1、Po2和Po3具有维管组织特异性 .