犬冠状病毒RT—PCR检测方法的建立和初步应用

根据Ｗｅｓｅｌｉｎｇ发表的犬冠状病毒（ＣＣＶ）Ｋ３７８株纤突蛋白（Ｓ）基因序列，设计合成了４条寡聚核苷酸引物Ｐ１（１８ｂｐ，１５２０～１５３７ｂｐ）、Ｐ２（１９ｂｐ，２０７２～２０９０ｂｐ）和Ｐ３（２０ｂｐ，２６２１～２６４０ｂｐ）、Ｐ４（２０ｂｐ，２９４４～２９６３ｂｐ）。以此为引物，以从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株反转录产物为模板，在国内首先建立了ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ方法，并初步应用于国内ＣＣＶ分离株的鉴定。结果表明，以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，只能从ＣＣＶＮＬ－１８株反转录产物中扩增出大小分别为５７１ｂｐ和３４３ｂｐ核苷酸片段，与理论设计值大小一致，而正常ＣＲＦＫ细胞和狂犬病等５种对照病毒扩增结果为阴性。ＲＴ－ＰＣＲ可检出１μＬ做１０５和１０３倍稀释的ＣＣＶＮＬ－１８株反转录产物，说明其具有很高的敏感性。初步应用试验结果，可从２株国内分离的ＣＣＶ反转录产物中扩增出５７１ｂｐ和３４３ｂｐ核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感、特异的ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ检测方法，也为其Ｓ基因的克隆和序列测定奠定了基础。     

番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定

利用ＰＣＲ技术,从纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３基因。将该ＰＣＲ扩增片段克隆入ｐＵＣ１８质粒载体的ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅠ位点之间,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３。结果表明：该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ２基因的克隆。     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

鹿流行性出血热新分离毒株VP7基因序列的分析

用美国新分离到的一株鹿流行性出血热血清Ⅱ型毒株、通过繁毒，提核酸，反转录，ＰＣＲ扩增，克隆质粒增殖提纯，最后应用７－脱氮－ｄＧＴＰ试剂盒测定期ＶＰ７核酸基因序列。该基因序列共有１１６２对碱基，与标准鹿流行性出血热病毒Ⅱ型基因序列比较，发现９对碱基有差别。     

应用套式PCR在MDCK细胞系中发现犬细小病毒

本研究自１９９７年至１９９９年从国内部分大学实验室、卫生防疫站和动检局陆续收集１１个犬肾（ＭＤＣＫ）细胞系样品,选取犬细小病毒基因组的ＶＰ２基因上４段核苷酸序列作引物,对样品ＤＮＡ进行套式ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）检测;ＰＣＲ扩增产物经０．０１ｇ／ｍＬ琼脂糖凝胶电泳和克隆到ｐＧＥＭ＾－Ｔ载体并进行核苷酸序列测序鉴定后,发现我国ＭＤＣＫ细胞系中存在犬细小病毒的传代病毒株。该病毒基因组部分序列测定结果显示与犬细小病毒ＣＰＶ－Ｎ株有９１％同源性。     

侵染葡萄的一种病毒分离物的鉴定

分离物采自葡萄呈扇叶,花叶症状的病叶（代号为ＧＦ）,人工摩擦接种能侵染昆诺藜（Ｃ．ｇｕｉｎｏａ）,苋色藜（Ｃ．ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）和葡萄（ＬＮ３３）,病毒致死温度（ＴＩＰ）为６０－６５℃,稀释限点（ＤＥＰ）为１０＾－２－１０＾－３,寄主体外存活期（ＬＩＶ）为３－４周,病毒粒体为球状,约３０ｎｍ,该分离物和葡萄扇叶病毒（ＧＦＶ）抗血清呈阳性反应。     

新城疫病毒Ulster株血凝素-神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株经ＳＰＦ鸡胚增殖和超速离心纯化后，以酚－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ，作为反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的模板。根据其已发表的Ｆ和ＨＮ基因核苷酸序列，合成一个长为３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于Ｆ基因内）和一对分别长为２８、３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于ＨＮ基因两侧）分别作为反转录引物和ＰＣＲ引物。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，出现一条长为１．９３ｋｂ的特异性条带，与预期相符。并将此特异性条带克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，并经限制性核酸内切酶分析（ＲＥＡ）。ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＥＡ结果证实其为新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中分别克隆出其Ｐ１０基因。从ＢｍＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基５端上游片段，经ＰＣＲ定位突变使之ＡＴＧ区突变成一个Ｂｇ１Ⅱ酶切位点。从ＡｃＭＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基因３端下游片段，克隆人经突变的ＢｍＮＰＶＰ１０基因启动子的下游，构建成一个新的转移表达载体ｐＢｍＡｃＰＶ－１，由于ＢｍＮＰＶ和ＡｃＭＮＰＶＰ１０基因及两端的同源性高达９０％以上，     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析‘

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒基因组ＲＮＡ,采用ＰＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＥＧＭ＾Ｒ－Ｔ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆,并进行了序列测定。序列分析表明：扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５５３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－ＲＱ－Ｋ－Ｒ－     

鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒ＧＤ－Ｐ１分离株Ｆ０裂解位点附件８８４ｂｐ的Ｆ基因ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒中,获得了重组质粒Ｔ－ｐＰＭＶ－Ｆ－Ｉ,核酸序列测定和分析表明,该片段与新城疫病毒强毒株Ｆ４８Ｅ９和ＨＥＲ／３３相应区域的同源性分别为８７．５％和８８．１９％,与新城疫病毒弱毒株ＬａＳｏｔａ和Ｂ１株的同源性分别为８３．８３％和８４．１５％。该病毒Ｆ０裂     

PCR技术鉴定中国株和西德株兔出血症病毒核酸

ＰＣＲ技术鉴定中国株和西德株兔出血症病毒核酸作者在先行构建兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）中国分离ＮＪ株ｃＤＮＡ克隆的研究基础上，采用酶切鉴定和地高辛标记ＮＪ株病毒核酸探针杂交鉴定，从已获得的ｃＤＮＡ克隆中筛选一克隆ＰＧＤ－１２．把其中插入片段亚克隆Ｍ１３噬...     

巢式RT-PCR检测昆明小鼠早期胚胎中G6PD基因表达

根据小鼠肌肉的６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）的ｃＤＮＡ序列设计并合成内外２对引物,以巢式ＲＴ－ＰＣＲ方法检测昆明小鼠１－,２－,４－,８－细胞期早期胚盈是否转录出Ｇ６ＰＤ的ｍＲＮＡ,结果发现１￣８－细胞期早期胚胎的ｍＲＮＡ均能以外引物扩增产物为模板通过内引物扩增出一条３７８ｂｐ特异性条带。表明昆明小鼠１￣８－细胞期早期胚胎的Ｇ６ＰＤ基因已表达,磷酸戊糖途径已是其代谢葡萄糖的主要方式之一。     

非洲猪瘟病毒(Malawi LIL 20/1株)k8R基因的表达与鉴定

蛋白多肽二级结构的电脑预测表明,非洲猪瘟病毒（ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１株）ｋ８Ｒ基因编码带有多个疏水氨基酸小区的２７ｋＤａ蛋白质。该基因的ＰＣＲ产物克隆入质粒ｐＧＥＸ－２Ｔ后,在大肠杆菌中表达４２～５４ｋＤａ不溶性ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白。此表达蛋白能被针对不同非洲猪瘟病毒株的猪免疫血清识别。在非洲猪瘟病毒细胞适应株感染的细胞中,针对ｋ８Ｒ大肠杆菌表达产物的单抗能检测出２７ｋＤａ特异病毒蛋白。进一步鉴定表明,ｋ８Ｒ基因编码的蛋白质为病毒非结构蛋白,不发生糖基化,出现于病毒感染周期的晚期,主要集中于靠近细胞核的病毒复制部位。用大肠杆菌表达的ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白免疫猪未能抵抗ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１强毒株攻击。     

非洲猪瘟病毒（Malawi LIL20／1株）k8R基因的表达与鉴定

蛋白多肽二级结构的电脑预测表明，非洲猪瘟病毒ｋ８Ｒ基因编码带有多个疏水氨基酸小区的２７ｋＤａ蛋白质。该基因的ＰＣＲ产物克隆入质粒ｐＧＥＸ－２Ｔ后，在大肠杆菌中表达４２－５４ｋＤａ不溶性ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白。此表达蛋白能被针对不同非洲猪瘟病毒侏的猪免疫血清识别。     

一种具有对映选择性催化萘普生乙酯水解的多克隆抗体

研究了一种具有对映选择性催化萘普生乙酯水解的多克隆抗体。先设计并合成消旋膦酸酯Ｐ１，与载体蛋白偶联得到适于动物免疫的抗原体系Ｐ２和Ｐ３，通过适当的分离和离子交换色谱处理，得到一种新的免疫球蛋白（ＩｇＧ）－多克隆抗体。它能加速Ｒ－构型萘普生乙酯水解成为Ｓ－构型，且具有高度专一性，此多克隆抗体为超分子识别。     

大麦黄矮病毒GAV株系通读蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶ）ＧＡＶ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ护增获得通读蛋白（readthrough protein RTP)基因的目的版段,将其重组到pGEM-7zf( )并转化ＪＭ１０９利到了含有完整ＲＴＰ基因的重组子,采用又脱氧终上法进行序列分析。结果表明,ＲＴＰ基因为１３３７nt,与文献报道的血清学较密切的ＢＹＤＶ ＭＡＶ－ＰＳ１相比,核苷酸和氨其酸的同源性分别为８７．４％和８７．１％。将些ＲＴＰ基因克隆到原核表达质粒pET-5a上,在大肠植菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中用ＩＰＴＧ旅导表达,利用 分离包含体的方法结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳,利到了纯化的分子是为６６ku的非融合蛋白。     

蚕豆上的菜豆卷叶病毒鉴定

从表现黄化和卷叶症状的蚕豆病株上分离到病毒Ｂ－２分离物。它只能由豆蚜、豌豆蚜、棉蚜和桃蚜以持久性方式传毒。豆蚜可以终生传毒，传病有间歇性。病毒Ｂ－２分离物可以侵染１４种豆科植物。酶联免疫吸附测定表明Ｂ－２分离物与菜豆卷叶病毒和甜菜西方黄化病毒有血清学关系。根据传病分体、寄生范围和血清学反应，将病毒Ｂ－２分离物鉴定为菜豆卷叶病毒（ＢＬＲＶ）的一个蚕豆株系，属于大麦黄矮病毒组。     

传染性喉气管炎病毒北京E2株gC基因的克隆及其部分序列测定

根据传染性喉气管炎病毒美国６３２株和英国Ｔｈｏｒｎｅ株ｇＣ基因的序列设计１对引物,以北京Ｅ２株为模板,用ＰＣＲ方法扩增到长度为１．９ｋｐ的片段,并将其克隆至质粒ｐＡ－Ｔ。用碱小量法制备质粒ＤＮＡ,以酶切和质粒ＰＣＲ的方法对其进行了鉴定,并以正向和反向引物测定其两翼序列,结果正向引物测出４９８个碱基,反向引物测出４９９个碱基,将所得序列输入ＧｅｎＢａｎｋ与其他毒株进行比较,结果发现其与美国６３２株的     

西瓜花叶病毒2号山西分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法，扩增获得西瓜花叶病毒２号（ＷＭＶ－２）山西分离物ＣＰ基因，并克隆到ｐＵＣ－Ｔ载体中，核苷酸序列测定结果表明，山西分离物ＣＰ基因全长为８４６个核苷酸，编码由２８１个氨基酸组成的３１．５ｋＤａ蛋白。与国外已报道的ＷＭＶ－２ＣＰ基因相比，其核苷酸序列同源性为９２．８％～９３．９％，由此推导的氨基酸序列同源性为９５．４％～９６．４％，山西分离物外壳蛋白有４个氨基酸残基明显不同于其它分     

春蚕豆花叶病毒的鉴定及防治途径

从我国甘肃等地春蚕豆区采集的蚕豆病毒病样本，经单斑分离得到病毒分离物Ｇ１７、Ｇ１２和Ｇ８。此８个分离要蚕豆均引起系统花叶症状；都能经姚蚜和豆蚜以持久性方式传播；传效率很高。经体外抗性测定，失活温度为５５－６０℃，稀释限点为１０＾－３～１０＾－４，体外存活期１－２天（２０～２５℃）。病毒粒体均为线形，大小明显的修饰作用。ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ试验证实，３个分离物与菜豆花叶病毒抗血清呈强耻性反应，反应值与