虫生广布拟盘多毛孢蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶产生水平及其毒力关系研究

[目的]了解虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株侵染和杀死松突园蚧过程中酶活性变化及作用机理.[方法]通过Folin-酚法、DNS法和对硝基苯酚法分别测定含1×104、1×105、1×106、1×107和1×108个孢子/mL系列浓度的GXSTYJ03菌株孢子悬浮液产生的蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶活力及其对松突圆蚧的致死率.[结果]GXSTYJ03菌株孢子含量越高,其产蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶的活力也越高;蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶的产酶高峰期和产酶活性均不相同,蛋白酶的产酶高峰期出现在发酵后第5d、几丁质酶出现在发酵后第6d、脂肪酶出现在发酵后第4~5d,GXSTYJ03菌株的蛋白酶活性远大于几丁质酶和脂肪酶活性;GXSTYJ03菌株5种孢子浓度产蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶活性与对松突圆蚧毒力呈极显著正相关.[结论]1×107个孢子/mL的GXSTYJ03菌株孢子悬浮液是产酶及杀虫的最佳使用量.蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶活性越高的菌株毒力越强,用于侵染和致死松突圆蚧的效果越好.     

球孢白僵菌胞外蛋白酶和几丁质酶活性与对亚洲玉米螟毒力的相关性分析

以振荡摇瓶培养法培养17株球孢白僵菌(Beauveriabassiana),分析其总胞外蛋白酶和几丁质酶的产生水平,同时用这些菌株的分生孢子粉作为样品,用人工饲养的亚洲玉米螟5d龄幼虫作为试虫,作毒力生物测定。并分析各个因素之间的相关性,验证各个酶活性指标作为毒力的生物测定的替代或者补充指标的可能性。结果表明,菌株间同代毒力、酶活之间的差异比较大,LT50的变化范围为4.82~10.06d,胞外蛋白酶活性的变化范围是0.86×10-2~3.66×10-2IU/mL,胞外几丁质酶活性的变化范围是0.012~1.47IU/mL。将后二者分别与各个菌株对玉米螟的LT50进行回归分析,结果发现胞外蛋白酶活性和胞外几丁质酶活性以及测定胞外蛋白酶活性时的干物质增重3个指标,与感染的亚洲玉米螟幼虫的死亡率及LT50的相关性都不显著,不能作为对亚洲玉米螟毒力的生物测定的替代或补充指标。     

白僵菌菌株毒力与Pr1蛋白酶活性相关性研究

利用专一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA对不同突变体菌株进行Pr1蛋白酶活性测定,同时应用玉米螟3龄幼虫对不同突变体菌株进行毒力测定,求算LT50值。以不同突变体菌株的Pr1蛋白酶比酶活为自变量,菌株毒力LT50值为因变量,进行相关性分析,得到突变体菌株的Pr1蛋白酶比酶活与毒力LT50值的线性回归方程:y=-2.411 6x+31.405,r2=0.521 6。由线性回归方程可以得出:不同突变体菌株的Pr1蛋白酶比酶活与菌株毒力LT50值呈负相关趋势,说明菌株的Pr1蛋白酶活性越高,菌株的LT50值就越低,菌株的毒力也就越大。两者相关系数r=-0.722 2,在0.05水平上相关显著,因此建议将Pr1蛋白酶的酶活性作为菌株初筛时的一个补充指标,但由于Pr1蛋白酶比酶活与菌株毒力LT50值相关性未达极显著水平,所以不建议将Pr1蛋白酶的酶活性作为菌株初筛时的替代指标。     

球孢白僵菌胞外酶的活性与其毒力的相关性

为了研究球孢白僵菌胞外酶的活性与其毒力的相关性,以黄粉虫为标准试虫测定9株球孢白僵菌的毒力,并分别测定其胞外蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的生产水平。相关分析表明,3种胞外酶活性与毒力的线性关系分别为y_1=-13.815 4x+185.954 4,r_1~2=0.495 7;y_2=-10.976 0x+58.977 0,r_2~2=0.432 5;y_3=-1.122 3x+8.469 5,r_3~2=0.830 3。由r~2值可以看出,胞外脂肪酶活性与毒力的线性关系最明显,脂肪酶活性可作为大量菌株毒力初筛的参考性指标。     

台湾黑僵菌F061菌株孢外酶活性及其对柑橘粉蚧毒力的相关性

室内测定台湾黑僵菌F061菌株的孢外酶活性及其对柑橘粉蚧的毒力,并通过线性回归分析探讨两者的相关性。结果表明:供试菌株的2种胞外酶活性均在1.00×10~8和1.00×107孢子·mL~(-1)2个处理时较高,其中蛋白酶活性达7.63U·mL~(-1)和7.61U·mL~(-1),几丁质酶活性达5.45U·mL~(-1)和5.67U·mL~(-1);供试菌株对柑橘粉蚧的LT50也在1.00×10~8和1.00×107孢子·mL~(-1)2个处理时较短,分别为4.98d和5.39d;线性回归分析表明,供试菌株对柑橘粉蚧的LT50与菌株蛋白酶活性呈显著负相关,与菌株几丁质酶活性呈中度负相关。可见,台湾黑僵菌F061菌株蛋白酶活性比几丁质酶活性强,在侵染柑橘粉蚧过程中起更直接的作用。     

绿僵菌几丁质酶活性及其对椰心叶甲毒力的相关性分析

用液体培养法和琼脂平板透明圈法研究了6个绿僵菌菌株的几丁质酶产酶水平与其对椰心叶甲毒力的关系。结果显示,各菌株的毒力大小顺序为JF813E>JF86CJ、F883>Ma4>JF83G>JF842;对椰心叶甲成虫的LT50值在6.3~8.0d之间;液体培养法所测酶活变化范围为5.9~38.4 IU/mL,琼脂平板法所得比值在1.37~2.43之间。表明不同绿僵菌菌株的产酶水平存在明显差异,且产几丁质酶水平的高低与其对椰心叶甲的毒力有一定的相关性;几丁质酶活性可以作为一个参考指标对绿僵菌菌种进行初步筛选,但不能完全代替毒力测定而成为菌种质量性状的检测指标。     

寄生松墨天牛的球孢白僵菌不同菌株DNA多态性的RAPD 分析

采用RAPD 技术对21 个不同来源的寄生松墨天牛Monochamus alternatus 的球孢白僵菌Beauveria bassiana 菌株的DNA 指纹图谱进行了测定。从RAPD 结果可知寄生松墨天牛的白僵菌菌株间具有丰富的遗传多态性。聚类分析把21 个寄生松墨天牛的白僵菌菌株分为两大类群:①B1 , B14 , B4 , B5 , B6 , B7 , B8 , B12 , B13 , B10 , F-263 , Bxs , B2 , B11 , Bf , Bz , B9 ;②B3 , B15 , By2 , By7 。结果表明菌株DNA 多态性与采集地之间有一定的相关性, 与对松墨天牛幼虫的毒力未表现出相关性。图2 表2 参11     

寄生松墨天牛的球孢白僵菌不同菌株DNA多态性的RAPD分析

采用RAPD技术对21个不同来源的寄生松墨天牛Monochamus alternatus的球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株的DNA指纹图谱进行了测定.从RAPD结果可知寄生松墨天牛的白僵菌菌株间具有丰富的遗传多态性.聚类分析把21个寄生松墨天牛的白僵菌菌株分为两大类群:①B1,B14,B4,B5,B6,B7,B8,B12,B13,B10,F-263,Bxs,B2,B11,Bf,Bz,B9;②B3,B15,By2,By7.结果表明菌株DNA多态性与采集地之间有一定的相关性,与对松墨天牛幼虫的毒力未表现出相关性.图2表2参11     

病原真菌降解两种蚧虫体壁过程中胞外酶作用

【目的】探究病原真菌降解蚧虫体壁过程中胞外酶的作用及其毒力效应,为应用病原菌对蚧虫进行生物防治提供依据。【方法】选用4株昆虫病原真菌-蜡蚧霉（Lecanicillium lecanii）菌株V3.4505、V3.4504、噬菌蚧霉(L. fungicola)菌株HEB02和镰刀菌Fusarium incarnatum-equiseti菌株HEB01,以日本龟蜡蚧（Ceroplastes japonicus Green）和沙里院褐球蚧（Rhodococcus sariuoni Borchsenius）为靶标害虫,以这两种蚧虫的表皮作为病原菌培养基的唯一碳源,测定培养过程中各菌株4种胞外酶的活性变化,包括脂肪酶、类枯草杆菌蛋白酶（Pr1酶）、几丁质酶和N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶（NAG酶）,并据此分析真菌入侵蚧虫体壁过程中胞外酶的作用。同时,测定两种蚧虫被4株病原真菌感染8 d后的死亡率,用于评价菌株和胞外酶的毒力效应。【结果】4株病原菌在降解两种蚧虫的体壁过程中,4种胞外酶的活性都发生了明显的变化,呈现先升高后降低趋势。脂肪酶的活性高峰出现得最早,在培养2 d后就达到最大值,且在日本龟蜡蚧上各菌株脂肪酶的活性明显高于沙里院褐球蚧。菌株的Pr1酶活性高峰出现在3-4 d,而几丁质酶和NAG酶的活性高峰分别出现在6 d和4-5 d。4个菌株相比较,V3.4505菌株对日本龟蜡蚧和沙里院褐球蚧的致死率均为最高,分别是73%和81%,且与HEB02菌株和HEB01菌株有差异显著。4个株菌的Pr1酶活性平均值与它们对日本龟蜡蚧和沙里院褐球蚧感染8 d后累计死亡率的线性相关性显著,线性方程分别为：y=0.082x+5.822（R²=0.823）和y=0.119x+14.75（R²=0.764）;4个株菌的几丁质酶活性平均值与两种蚧虫累计死亡率的线性相关也较显著,线性方程分别为：y=-0.148x+15.89（R²=0.645）和y =0.095x+10.46（R²=0.762）。【结论】在对两种蚧虫的感染过程中,病原真菌的4种胞外酶均参与了对蚧虫蜡质和体壁的降解。脂肪酶降解虫体表面的蜡质,酶活性高峰出现最早,在蜡壳厚的日本龟蜡蚧上其酶活性表现得更高。在其余3种酶中,先由Pr1酶作用,降解蚧虫原表皮中的蛋白质,再由几丁质酶和NAG酶作用,降解几丁质。酶作用高峰时间与酶活性大小与其底物在蚧虫体壁中的排列层次与含量相吻合。菌株的酶活性和蚧虫致死率相关性分析说明,Pr1酶和几丁质酶可作为菌株的毒力指示因子。4个菌株相比较,蜡蚧霉V3.4505菌株表现出较好的致病特性,说明其对蚧虫的毒力较高,可考虑作为蚧虫生物防治应用的病原菌种。     

松墨天牛寄生白僵菌的优良菌株筛选

对21个球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株的生长、产孢能力、抗逆性等生物学性状以及对松墨天牛(M.alternatus)4龄幼虫的毒力进行了全面的比较研究。综合各菌株的生物学特性和对天牛幼虫的毒力指标,最终得出防治松墨天牛幼虫最优良菌株是来自浙江象山的Bxs和来自江苏的B5菌株,其中Bxs在生长指标上略占优势,B在抗性指标上略占优势。     

白僵菌和绿僵菌不同菌株对橙斑白条天牛幼虫的致病力

橙斑白条天牛是福建省杨树的一种新害虫,应用不同球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株对橙斑白条天牛幼虫进行致病力测定,旨在筛选出感染该虫的高致病力菌株,为生物防治提供新的资源。结果表明,接种后,该天牛幼虫的累积死亡率随时间的延长而逐渐增高,接种绿僵菌Ma1291-2和Ma1775菌株14 d后,幼虫的校正死亡率分别为91.69%和86.50%;接种白僵菌BbDp-06菌株14 d后,幼虫校正死亡率达71.05%。绿僵菌Ma1291-2和Ma1775菌株对该幼虫的LT50分别为5.73和5.39 d,白僵菌BbDp-06菌株的LT50为8.02 d。Ma1291-2菌株对该幼虫的LC50为3.82×104孢子.mL-1,白僵菌BbDp-06菌株的LC50为3.88×104孢子.mL-1。说明绿僵菌对该幼虫的致病力较强,尤其是Ma1291-2和Ma1775菌株,在橙斑白条天牛的生物防治中将有较好的应用价值。     

利用白僵菌防治松褐天牛的试验研究

通过生物测定筛选出对松褐天牛毒力较高的菌株Bb202,用该菌株生产白僵菌无纺布菌条和高孢粉用于野外防治松褐天牛,结果表明,防治后松褐天牛的虫株率下降了0.9%,下降幅度达31.1%;无纺布菌条处理区解剖木中的幼虫死亡率为61.8%,高孢粉处理区为52.5%,对照区为45.6%.挂笼试验中,无纺布菌条处理区解剖木的幼虫死亡率为41.9%,高孢粉处理区为62.0%,对照区为32.3%,说明用白僵菌防治松褐天牛有一定的效果.     

三株丝孢虫生真菌对松墨天牛幼虫的感染效应

 生物测定了球孢白僵菌（Beauveria bassiana）Bb050715,Bb060721菌株和粉拟青霉（Paecilomyces farinasus）Pf0607菌株对松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）的感染效应。结果表明,球孢白僵菌及粉拟青霉对松墨天牛幼虫的毒力有一定的差异,3株丝孢真菌侵染三龄幼虫后,均造成虫体血淋巴中蛋白质含量降低,且球孢白僵菌侵染后血淋巴中总蛋白含量明显低于经粉拟青霉接种处理感染后的虫体。供试3菌株中,球孢白僵菌菌株处理后天牛累积死亡率明显高于粉拟青霉菌株,对天牛幼虫感染的剂量效应参数分别为0.45,0.45和0.39,对松墨天牛三龄幼虫的毒力回归方程分别为Y=13.537X-4.603²(R²=0.97),Y=15.361X+0.444 4(R²=0.97)和Y=9.138X-3.100 1(R²=0.99)。在1.36×10⁴～1.36×10⁹孢子/mL下处理后第4d才出现死亡,Bb050715,Bb060721和粉拟青霉3菌株接种处理后第4～8d的累积死亡率分别为13.3%～80.0%,13.3%～86.7%,6.7%～53.3%,LT₅₀依次为5.1,5.1和7.7d,第5 d的LC₅₀分别为7.23×10⁸孢子/mL,1.53×10⁸孢子/mL,7.27×10⁹孢子/mL。     

用球孢白僵菌和粉拟青霉防治美国白蛾的研究

美国白蛾下树化蛹的过程为昆虫病原真菌与之接触侵染提供了有利环境。从来源于河北、北京地区的22株球孢白僵菌和2株粉拟青霉菌中,筛选出对美国白蛾高致病力的球孢白僵菌菌株FD和粉拟青霉菌株SH9-4,通过爬行接触接种的方法,测定了它们对进入下树化蛹过程的美国白蛾老熟幼虫的侵染效果。研究表明,接种144 h后,白僵菌校正致死率92.4%,LT50为87.06 h;粉拟青霉校正致死率94.9%,LT50为92.34h;受感染的老熟幼虫多在预蛹阶段死亡。同时,对生产出的白僵菌和粉拟青霉的固体菌剂,通过在树干基部施菌的方法进行了小规模的野外防治试验。结果表明,白僵菌和粉拟青霉对越冬代美国白蛾幼虫的防治效果分别为72.9%和83.5%,对第2代美国白蛾幼虫的防治效果分别为88.4%和87.0%。表明针对美国白蛾下树化蛹进行防治是用真菌防治美国白蛾可行的途径。     

白僵菌和绿僵菌蛋白对松墨天牛致病性的研究

从4株白僵菌和1株绿僵菌中提取了10种全蛋白提取液,以林业害虫松墨天牛幼虫为试虫,筛选出菌株Bb36的全蛋白提取液Bb36W-Z和Bb36N-Z,再从中分离出12种单一蛋白提取液,生测发现虫生真菌蛋白Bb36W-D对松墨天牛幼虫具有较强的注射毒性,经其处理后的试虫酯酶谱发生明显变化,致使松墨天牛幼虫内部组织发生病变.     

松墨天牛幼虫真菌病侵染途径研究

为了探讨生物防治方法控制松材线虫病的发生和发展,开展了松材线虫病死木昆虫区系调查及虫种鉴定,进行了白僵菌孢子萌发试验和人工侵染试验。结果表明,在松材线虫病死木中,松纵坑切小蠹、马尾松梢小蠹、松瘤小蠹、额毛小蠹、松墨天牛为优势种。所用白僵菌株的孢子萌发率和萌发时间之间存在显著相关,相关系数均达0.9以上。中山陵地区的几种主要小蠹均能被白僵菌所感染,即均具有携带白僵菌孢子的能力。由此推测,松墨天牛幼虫感染白僵菌的途径很可能是:某种小蠹虫先感染白僵菌,然后该小蠹虫经过二次侵染,将白僵菌孢子转移给松墨天牛幼虫,从而导致松墨天牛幼虫感病。     

球孢白僵菌胞外蛋白酶与其毒力的关系

用液体培养和明胶脂平板法研究了球孢白僵菌不同菌株以及不同世代的胞外蛋白酶产酶水平与其毒力的关系,试验结果表明,不同菌株间以及同一菌株的不同世代间产酶水平存在着明显的差异,而且产酶水平的高低与其对马尾松毛虫的毒力存在着明显的线性相关性。