兔出血症病毒主要结构多肽的纯化及免疫保护性试验

人工感染ＲＨＤＶ－ＮＪ株病死兔肝经－５０℃反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、差速离心,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒,纯化ＲＨＤＶ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣｕＣｌ２负染色后,切取主要结构多肽ＶＰ１（６４．５ＫＤ）凝胶带,除去ＣｕＣｌ２和ＳＤＳ获得ＶＰ１,高效液相色谱鉴定只有一个蛋白峰,Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ,ＨＡ和ＨＩ结果显示纯化ＶＰ１具有良好的抗原表位稳定性。无母源抗体的３月龄兔１     

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL^-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV 亚单位疫苗提供了参考。     

Structure of the multidrug transporter EmrD from Escherichia coli

EmrD is a multidrug transporter from the Major Facilitator Superfamily that expels amphipathic compounds across the inner membrane of Escherichia coli. Here, we report the x-ray structure of EmrD determined to a resolution of 3.5 angstroms. The structure reveals an interior that is composed mostly of hydrophobic residues, which is consistent with its role transporting amphipathic molecules. Two long loops extend into the inner leaflet side of the cell membrane. This region can serve to recognize and bind substrate directly from the lipid bilayer. We propose that multisubstrate specificity, binding, and transport are facilitated by these loop regions and the internal cavity.     

融合蛋白VP4-STI的免疫效果观察

为了研究融合蛋白VP4-STI的免疫效果。将40只小鼠随机分为实验疫苗组(30μg VP4-STI+0.6μg LTB)、铝胶疫苗组[30μg VP4-STI+Al(OH)3胶]、纯化蛋白VP4-STI疫苗组(30μg VP4-STI)和PBS对照组,通过鼻腔滴入进行免疫,测定其抗体水平。用大肠杆菌强毒株C83902进行攻毒试验,观测各免疫组小鼠的保护效果。除PBS对照组外,其余各组均有抗VP4-STI抗体产生,第6周最高,铝胶疫苗组的抗体水平略高于实验疫苗组,纯化蛋白VP4-STI免疫组较低,与实验疫苗组差异极显著(P<0.001)。实验疫苗组和铝胶疫苗组小鼠对大肠杆菌强毒株C83902均有较好的免疫保护效果,与对照PBS组有明显差异。该研究为进一步提高STI的免疫原性提供了依据。     

原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果

 为了检验大肠杆菌表达的兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白（VP60）对兔的免疫保护效果，将34只清洁兔随机分成3组：单用免疫佐剂对照组（8只）、单用重组VP60组（8只）和重组VP60加免疫佐剂组（18只），分别经皮下注射，VP60的免疫剂量为每只每次400 μg，免疫2次，间隔7 d。在第2次免疫7 d后，VP60加免疫佐剂组的兔血清抗体水平显著高于单用VP60免疫组（ELISA 1∶64 000 对比1∶4 000 / HI 1∶128 对比1∶16），表明免疫佐剂可明显加速重组VP60诱导抗体产生的进程，用RHDV NJ85强毒攻击，免疫佐剂对照组与单用VP60免疫组的实验兔均全部死亡（8/8和8/8），VP60加免疫佐剂组均全部存活，保护率为100%（18/18）。用RHDV血凝试验（HA）检测，死亡兔的肝脏组织液HA效价大于1∶512，而存活兔的肝脏组织液HA效价小于1∶2，肝脏组织触（涂）片检查和细菌培养均为阴性，证明病死兔系RHDV感染所致。用RHD重组亚单位疫苗在养兔场进行800只兔的田间免疫试验，安全有效，没有出现不良反应。对重组菌进行冻存、复苏、培养、诱导表达和质粒酶切分析，证明VP60基因在宿主菌内保持稳定。     

融合蛋白VP4-STI的免疫效果观察

研究显示，肠毒素是ETEC致幼畜腹泻的根本原因，由ETEC产生的肠毒素包括热敏感肠毒素（LT）和热稳定肠毒素（ST），其中ST又包括STI和STII。调查表明，几乎所有的腹泻幼畜只要分离到ETEC大部分都产生STI，但是，由于STI的分子量太小，几乎没有免疫原性，因此，通过基因融合的方式借助大分子物质提高STI的免疫原性是当前国内外学者致力于ETEC疫苗开发的重点。     

O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

C型口蹄疫病毒VPI基因的克隆及真核表达载体的构建

应用PT-PCR扩增C型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体中,并对克隆载体和VP1基因进行序列分析。将VP1基因和选择标记基因——二氢叶酸还原酶（dhfr）基因插入真核表达载体pCI-neo中,对所构建的重组真核表达载体进行PCR扩增、酶切鉴定和序列分析。结果表明,VP1基因与GenBank中标准毒株（登录号EU553893）VP1的序列同源性为92.8%,VP1基因的真核表达载体pCI-VP1-D构建成功。     

牛轮状病毒VP4基因与LTB基因的融合表达及免疫原性研究

PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价

为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RTPCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,得到重组质粒pETVP7,酶切鉴定后,将pETVP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDSPAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产生;攻毒试验结果表明,0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%,对照组为0,表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。     

脑心肌炎病毒VP1蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路和促进病毒体外增殖

脑心肌炎病毒是一种重要的人畜共患病病原,为了初步研究EMCV介导的天然免疫反应的分子机制,将VP1蛋白克隆至真核表达载体pCMV-HA,转染HEK293细胞后,使其在细胞内过表达,通过ELISA和实时荧光定量PCR检测VP1过表达对IFN-β表达和RLRs信号通路相关因子,以及下游刺激基因表达的影响。结果表明,VP1蛋白可显著抑制IFN-β的表达。进一步研究发现,VP1可显著抑制EMCV引起的RLRs信号通路相关因子mRNA水平(P<0.01),并且随着VP1的表达,MAVS蛋白的表达明显减少,但对MDA5表达无影响。实验数据初步表明,VP1蛋白可以通过抑制MAVS的表达,进而抑制Ⅰ型IFN基因的表达并阻断其下游信号通路发挥作用。     

鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达

采用湖北省云梦县患鹦鹉幼雏病死亡的虎皮鹦鹉体内分离得到的鹦鹉幼雏病毒(budgerigar fledgling disease virus，BFDV)，应用PCR方法获得BFDV主要结构蛋白基因(VP1)，克隆到pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-VP1并进行测序，结果显示，结构蛋白基因(VP1)与BFDV欧美分离株的同源性为96％～99％，表明VP1是BFDV保守基因；将VP1亚克隆到原核表达载体pET32( )b，构建重组质粒pET32( )b-VP1，转化菌株BL21(DE3)，诱导表达，经SDS-PAGE和Westem-blot分析，克隆在his-tag下游的结构蛋白基因获得了高效融合表达，表达的融合蛋白分子量约为55 kD。为建立快速、灵敏的鹦鹉幼雏病毒血清学检测方法以及研制基因工程疫苗提供了科学依据。     

Sound velocities of hot dense iron: Birch's law revisited

Sound velocities of hexagonal close-packed iron (hcp-Fe) were measured at pressures up to 73 gigapascals and at temperatures up to 1700 kelvin with nuclear inelastic x-ray scattering in a laser-heated diamond anvil cell. The compressional-wave velocities (VP) and shear-wave velocities (VS) of hcp-Fe decreased significantly with increasing temperature under moderately high pressures. VP and VS under high pressures and temperatures thus cannot be fitted to a linear relation, Birch's law, which has been used to extrapolate measured sound velocities to densities of iron in Earth's interior. This result means that there are more light elements in Earth's core than have been inferred from linear extrapolation at room temperature.     

Hydrophobic organization of membrane proteins

Membrane-exposed residues are more hydrophobic than buried interior residues in the transmembrane regions of the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides. This hydrophobic organization is opposite to that of water-soluble proteins. The relative polarities of interior and surface residues of membrane and water soluble proteins are not simply reversed, however. The hydrophobicities of interior residues of both membrane and water-soluble proteins are comparable, whereas the bilayer-exposed residues of membrane proteins are more hydrophobic than the interior residues, and the aqueous-exposed residues of water-soluble proteins are more hydrophilic than the interior residues. A method of sequence analysis is described, based on the periodicity of residue replacement in homologous sequences, that extends conclusions derived from the known atomic structure of the reaction center to the more extensive database of putative transmembrane helical sequences.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备(

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHV VP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

VP3基因突变鸡传染性贫血病毒的构建

以含CAV标准毒CuX-1株VP3突变体的pTCAVM阳性质粒为基础,通过重叠PCR在基因组位点nt682、nt808、nt829处进行定点突变,构建pTCAVM1、pTCAVM2、pTCAVM3突变体;在此基础上,对上述3个位点进行组合定点突变,构建成功pTCAVMa、pTCAVMb、pTCAVMc突变体;此外,成功构建克隆出3个位点均发生突变的pTCAVMd突变体。所有的突变体都保证VP3定点突变位点的碱基变化,同时不引起VP2蛋白的氨基酸残基序列发生变化,保证了突变体和原始病毒抗原性的一致;将得到的突变体转染易感细胞MSB1,获得具有复制特性的病毒,将病毒接种1日龄的SPF雏鸡,发现病毒可以在鸡体内复制,并引起CAV感染的病理学变化。本研究成功获得了多株感染性克隆毒株,为研究CAV病毒致病性以及开发鸡贫血弱毒活疫苗奠定了坚实的基础。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础