原位PCR原理及应用

原位PCR是一种灵敏度特别高的基因水平上检测技术,该技术通过将原位杂交技术和普通的PCR技术相结合,从而可以检测出组织或细胞中低浓度的特异序列。为促进原位PCR技术的发展完善,简要介绍了原位PCR的基本原理、流程及应用情况。     

引物原位标记技术及其应用

本文综述了近几个来引物原位标记技术的发展和应用，并以检测猪染色体端位序列为例，介绍了这项技术的基本原理和实验程序。现已表明，引物原位标记技术不仅可以应用于检测染色体特定的ＤＮＡ序列，而且可以应用于在细胞和组织切片上检测特定的ＲＮＡ序列。     

木薯MeEFⅠ基因的原位PCR物理定位

用原位PCR技术将木薯延长因子基因（MeEFⅠ）定位到木薯染色体上,根据MeEFⅠ基因的全长cDNA序列设计该基因的特异引物,以华南6号木薯根尖为材料制备染色体标本,结果表明：通过原位PCR检测发现,在木薯细胞不同时期的分裂相上均能发现1～2个荧光信号位点;通过核型分析,初步将木薯MeEFⅠ基因定位于华南6号木薯的第1...     

植物染色体分子核型技术研究进展

单染色体识别为植物遗传学、生物多样性和进化研究的重要方向,也是大型基因组多倍体植物研究的难题之一。文章综述了单拷贝序列染色体涂染(single-copy sequence based chromosome painting)和寡核苷酸荧光原位杂交(oligonucleotide FISH,Oligo-FISH)技术合成新型探针池的方法,总结其在比较基因组学研究中的应用案例,提出开发近缘物种通用寡核苷酸探针库的研究趋势,并对植物染色体分子核型技术在植物系统发育重建和植物育种中的应用进行了展望。     

植物流式细胞遗传学及其应用研究进展*

 流式细胞遗传学是利用流式细胞术对植物有丝分裂细胞的染色体进行分离、纯化和分选等操作的细胞遗传学分支学科,已在许多领域广泛的应用,如与DNA 分子标记结合进行物理作图,利用FISH和PRINS进行细胞遗传作图,重组DNA文库的构建,标记片段的定向分离以及蛋白质分析。利用流式细胞技术已对数十种植物物种进行了染色体分析,应用最多的是豆类作物和禾谷类作物。流式细胞术有许多潜在的利用价值,主要包括植物染色体和染色体臂特异BAC文库的构建,低拷贝序列的目标分离,ESTs和杂交DNA 序列的高产量作图以及对染色体蛋白的整体分析等。本文综述了植物流式细胞遗传学的研究方法及其在植物研究中的应用,并对其在植物基因组分析的潜在利用价值作了展望。     

普通荞麦染色体的原位PCR技术研究

[目的]探索一种适合荞麦的简单易行的染色体原位PCR技术。[方法]采用16S套式引物、4.5S套式引物与psbA引物,以栽培甜荞为材料,进行了染色体原位PCR、原位套式PCR与多次原位PCR试验。[结果]高温干燥可以起到与包埋类似的作用;染色体的原位套式PCR效果比原位PCR明显;多次原位PCR次数为5～6效果较佳。16S引物和4.5S引物均显示了4对信号,但位置不同;而psbA引物是单拷贝的,仅显示出1对信号。根据这些信号得位置差异可以区分普通荞麦的5对染色体。[结论]所使用的荞麦染色体原位PCR技术简单易行。     

普通荞麦染色体的原位PCR技术研究

[目的]探索一种适合荞麦的简单易行的染色体原位PCR技术。[方法]采用16S套式引物、4．5S套式引物与psbA引物，以栽培甜荞为材料，进行染色体原位PCR、原位套式PCR与多次原位PCR试验。[结果]高温干燥可以起到与包埋类似的作用；染色体的原位套式PCR效果比原位PCR明显，多次原位PCR次数为5-6效果较佳。16S引物和4．5S引物均显示了4对信号，但位置不同；而psbA引物是单拷贝的，仅显示出1对信号。根据这些信号的位置差异可以区分普通荞麦的5对染色体。[结论]所使用的荞麦染色体原位PCR技术简单易行。     

荧光原位杂交在作物遗传育种研究中的应用

荧光原位杂交是一种原位杂交新技术，具有快速，灵敏，准确和有效等特点，它采用生物示记探针，能够将特定的ＤＮＡ或ＲＮＡ序列直接定位于染色体上，该文就荧光原位杂交技术在作物遗传育种研究中的应用进行综述，主要包括以下方面：１）检测重复ＤＮＡ序列及多拷贝基因家族；２）鉴定异源多倍体物种中的异源染色体或染色体片段；（３）检测和定位低拷贝或单拷贝ＤＮＡ序列。随着一些新技术的发展，ＦＩＳＨ技术将会在作物育种的更多     

偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用

【目的】偃麦草(Thinopyrum)是小麦(Triticum aestivum L.)的多年生野生近缘植物,具有许多可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum(Host)Liu and Wang)基因组特异重复序列,可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库,并对文库进行高密度点杂交(Dot-blot hybridization)筛选,结合荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,获得偃麦草基因组特异的重复序列,分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用Repeat Masker在小麦族重复序列数据库(Triticeae repeat sequence database,TREP)及NCBI Gen Bank对特异重复序列进行比对分析,并设计偃麦草基因组特异重复序列的PCR引物。通过FISH分析和特异PCR引物扩增,对小麦-偃麦草衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得7条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH分析表明,其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布,且在不加小麦封阻DNA的情况下,能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中,特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段,而且信号相比基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了90对引物,通过在中国春、十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析,筛选出36对(40%)偃麦草基因组特异PCR标记;利用这些特异引物对109份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描,发现10对扩增效果较好的特异引物,其检测效率为73.3%—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列,开发了特异PCR扩增引物,可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪。     

植物特异DNA序列应用研究进展

植物特异DNA序列是指在某些植物属、种、基因组或染色体上单独具有的特异存在的DNA序列。几乎所有的高等生物基因组中都有一些物种或基因组特异(有)的DNA序列。研究这些特定序列,对研究物种间在进化过程中的关系及现有物种间的亲缘关系、特异性状表达等方面有着重要的意义。简述了植物特异DNA序列的种类,总结了利用特异DNA序列作为与某一性状基因连锁的分子标记的应用情况,以及特异DNA序列在鉴定外源染色体的来源、某一染色体组或基因组、某一物种或属植物等方面的应用情况,提出了存在的问题与应用前景。     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低,对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难,位点特异性核酸酶的出现和应用,大大提升了同源重组的效率,使基因组编辑变得更加高效和精确,从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。锌指核酸酶（ZFN）和TALE核酸酶（TALENs）是能够使DNA的靶位点产生DNA双链断裂进而实现基因组定点编辑的常用系统,但在具体应用中发现这两种系统存在着许多缺陷和不足,如脱靶效应、与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等,另外技术难度大、构建组装时间长也限制了其应用。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经过密码子优化等改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,具有突变效率高、制作简单、易操作及成本低的特点。目前,该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的indel突变等。目前,CRISPR/Cas系统在植物中的应用还比较有限,但该技术为植物基因工程的发展呈现了美好的前景。文中首先简要介绍了CRISPR/Cas系统的组成和基本原理,进而详细综述了该技术在植物内源基因和外源基因定点编辑中的应用,主要列举了自CRISPR/Cas系统改造成功以来利用该系统对单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望,希望能够为开展该领域研究的科研工作者提供参考。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

Quantitative analysis of the interaction of heterologous viruses with Plum pox virus in C5 HoneySweet transgenic plums

Stone fruits are an important crop in most parts of the world and are heavily challenged by several viruses including Plum pox virus(PPV), Prune dwarf virus(PDV), Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV), and Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV). We validated the PPV resistance in C5 plum plants(commercially known as Honey Sweet) grown in the Czech Republic for more than 16 years in a field trial experiment under natural environmental conditions. We quantified single(PPV-Rec) and mixed viruses(PPV-Rec+ACLSV, PPV-Rec+PDV and PPV-Rec+ACLSV+PDV) in C5 transgenic plums inoculated for the period 2016 to 2018. The accumulation of PPV-Rec was high(～5.43 E+05 copies) compared with that of ACLSV(～8.70 E+04 copies) in the inoculated graft of C5 transgenic plants. Leaves close to the inoculum sources showed a differential level of virus titre in single and mixed infections(～10 to ～5×10~2 copies). C5 plants with permanent virus pressure showed 10~3-to 10~5-fold fewer copies of viruses than those of the inoculated graft. We observed high accumulation of conserved mi RNAs such as mi R167, mi R69 and mi R396 in C5 plants co-infected with PPV, ACLSV and PDV that are associated with its resistance against viruses. Overall, i) C5 transgenic plums showed high resistance to PPV infection, and a low level(～32 copies) of PPV only accumulated in some grafted plants, ii) high accumulation of PPV was found in inoculated grafts in single PPV infection and mixed infections, iii) heterologous virus infection sustained by ACLSV or PDV did not suppress PPV resistance, and iv) high and low conserved micro RNAs accumulated in C5 plants.     

黑麦染色体组中一个新重复序列的发现、定位与应用

 【目的】寻找黑麦基因组中新的重复序列作为特异PCR标记。【方法】以普通小麦中国春、川农18、育成品系R111、绵阳11为对照，以荆州黑麦、秦岭黑麦、非洲黑麦、森林黑麦为材料，用RAPD法筛选到黑麦基因组中的一个高拷贝DNA片段OPD15940，将OPD15940输入到NCBI的BLAST框中进行比对。根据OPD15940设计特异PCR引物D15F和D15R，利用这对引物对小麦族物种进行扩增，验证OPD15940的特异性。进而利用原位杂交技术定位pScD15940在染色体上的位置。【结果】序列比对后发现OPD15940与重复序列Sukkula中近60个53bp的小片段有较高的同源性，但又不同于Sukkula，是一类新的重复序列。通过特异PCR确定仅含黑麦染色质的物种能扩增出OPD15940，因而OPD15940为黑麦所特有。原位杂交结果显示除端部区域外，pScD15940弥散状分布在黑麦整套染色体上。【结论】OPD15940可以作为分子标记检测导入到小麦背景中的黑麦染色体。     

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN₂及HN₃处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN₂到HN₃）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计特异性引物进行PCR检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1142bp的3′端旁侧序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性从MON89788大豆中扩增出170bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

参与农杆菌侵染及T-DNA转运过程植物蛋白的研究进展和思考

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤病原细菌,携带具有天然转基因功能的Ti质粒或Ri质粒,能将一部分遗传物质插入到寄主植物的染色体上,使其稳定遗传和表达,赋予植物新的性状。所以农杆菌作为最有效的转化媒介,已被广泛应用于多数双子叶植物和部分单子叶植物转基因研究。虽然农杆菌介导的转化技术具有操作简单、成本低廉,转基因沉默几率小,插入基因拷贝数少等优点,但农杆菌介导植物遗传转化是一个复杂的生物学过程,需要一系列农杆菌蛋白和植物蛋白相互作用,共同完成外源基因的转入和整合。植物相关蛋白在转化过程中起着重要作用。其中,阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)、植物根钙粘附蛋白和类玻连蛋白等参与农杆菌附着于植物细胞表面的过程;鸟苷三磷酸腺苷酶（GTPase）和BTI蛋白协助T-DNA和Vir效应蛋白进入植物细胞;actin、GIP、VIP等蛋白参与T-DNA复合体在细胞质中的运输的过程;与Vir效应蛋白互作的VIP1、VIP2、KAPa、PP2C、Roc等蛋白协助T-DNA定位于植物细胞核;组蛋白、VIP1和VIP2等引导T-DNA在植物基因组上的整合。由于植物种类间存在巨大差异,上述一些植物蛋白基因的过表达虽能提高农杆菌转化某些植物的转化效率,但不能提高另一些植物的转化效率。在容易被农杆菌遗传转化的植物如拟南芥、水稻中的研究表明,VIP1、VIP2、AGP、H2A等蛋白与农杆菌转化关系密切,但这些蛋白在利用农杆菌转化较难的作物如小麦、玉米中的功能还不明确,因而需要在不同植物中继续筛选和鉴定与T-DNA转化相关重要蛋白的编码基因。目前,农杆菌介导的植物遗传转化有2个显著特点,一是农杆菌介导转化烟草、拟南芥、水稻等模式植物的技术日渐成熟,二是农杆菌介导转化小麦、玉米、大豆等重要作物的技术仍然没有本质突破,植物相关蛋白在T-DNA转运、整合等过程中的作用还需要深入研究和进一步明确。文章主要对参与农杆菌介导遗传转化植物整个过程中相关植物蛋白的研究进展进行了综述,以期为提高农杆菌转化顽拗型作物的转化效率提供参考。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文）

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。