H3亚型猪流感病毒HA基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记H3亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的保守片段制成核酸探针,与H3及H1亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病病毒(PRV)的DNA进行斑点杂交,检测探针的特异性.结果显示,该探针仅与H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验结果显示,探针最低能检出约6 pg/μL的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出4份阳性病料,与RT-PCR检测结果一致.研究表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对H3亚型SI的诊断和流行病学调查.     

RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒(SIV)的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法.应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100%.敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

猪流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank发表H1N1、H1N2和H3N2亚型猪流感病毒M基因片段的引物序列,设计合成1对引物,建立猪流感病毒RT-PCR检测方法。结果表明：建立的方法能扩增出675bp的基因片段,同条件扩增伪狂犬病毒、猪瘟病毒、圆环病毒Ⅱ型及猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;该方法可检测到3.5pg猪流感的核酸,能从被流感病毒感染的小白鼠和疑似猪流感的病料中检测到猪流感病毒。结果表明,建立的猪流感病毒RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和重复性好等特点,适用于对H1N1、H1N2和H3N2亚型猪流感病毒的快速诊断。     

在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型 cDNA

 对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）、A/African starling/983/79（H7N1）和 A/Turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）。通过RT-PCR获得大约500 bp的禽流感病毒基因cDNAs片段，克隆，从重组质粒扩增DNA片段，并点到玻璃载体上，制成芯片。在病毒RNA反转录过程中，用Cy5标记样品 cDNAs。样品 cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型，依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点，杂交信号与预期设想基本一致。结果显示，DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。     

禽流感H5和H9亚型基因探针的制备

参照GeneBank数据库上H5N1和H9N2 AIV的HA基因序列,选取保守区域,设计了两对引物,分别用于扩增HA基因,产物纯化回收得到180 bp和285 bp cDNA片段,采用随机引物法Digxigenin11-dUTP标记得到探针H5PR和H9PR,通过斑点杂交检测,结果表明探针的灵敏度高和特异性好,可以进行相关性试验.     

H1N1亚型猪流感病毒3种谱系三重RT-PCR检测方法的建立与应用

以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)3种主要谱系2009甲型H1N1(pdm/09 H1N1)、古典型H1N1(CS H1N1)和类禽型H1N1(a H1N1)的血凝素(Hemagglution,HA)基因为靶基因,设计3对特异性引物,建立一种可以同时检测一个反应体系中H1N1亚型3种主要谱系SIV的三重RT-PCR方法,并将其应用于临床样品的检测,旨在为开展猪群中流行的H1N1亚型SIV感染及流行情况的调查研究提供有力技术支撑。结果显示,该方法可对pdm/09 H1N1、CS H1N1和a H1N1这3个不同谱系SIV特异性检出,扩增片段大小分别为476 bp、293 bp和997 bp,而与其他病毒无交叉反应;最低检测限分别为1 460拷贝/μL、1 700拷贝/μL和1 950拷贝/μL;应用到3 110份临床样品检测中,检测出10株pdm/09 H1N1和21株a H1N1 SIV,未检测到CS H1N1 SIV,与鸡胚分离病毒符合率达100%。综上,该方法敏感性和特异性良好,能快速、有效实现对临床样品中H1N1亚型3种谱系的检测。     

H1N1亚型猪流感病毒M基因、NS基因克隆与序列分析

根据GeneBank 中流感病毒 H1N1亚型M基因和NS基因序列,分别设计扩增M基因和NS基因的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪流感病毒天津株M基因和NS基因,分别将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行序列测定和分析.结果显示M基因全长1027 bp,其核苷酸序列与参考毒株间的同源性在85.8 %～99.7 %,NS基因全长890 bp,与参考毒株之间的核苷酸序列同源性在80.7 %～99.2 %.M和NS基因的系统发育树显示:TJ2、TJ4株与我国香港、上海和广东H1N1亚型猪流感病毒属同一分支,但与上海、广东分离株的亲缘关系更近;与2009年全球流行的人甲型H1N1流感病毒变异株和部分国外猪流感疫苗株的亲缘关系相对较远.     

基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因.熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(795±03)℃和(833±03)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列.该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰.AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA 无扩增信号.本法最低可检测210拷贝·μL-1和195拷贝·μL-1 H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍.本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于H5N1亚型AIV的检测.     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增的778 nt片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框．核苷酸序列比较分析结果表明,该毒株与A／Swine／Texas／4199-2／98(H3N2)、A／Swine／Iowa／533／99(H3N2)、A／Swine／HongKong／126／ 82(H3N2)、A／Swine／Pingtung／7-12／99(HIN2)核苷酸序列的同源性为92．7％～98．6％,推导的氨基酸序列同源性为92．6％～96．3％．     

5株野鸭源H6N1亚型禽流感病毒NA基因的克隆和进化分析

根据GenBank已知的H6N1亚型流感病毒的NA基因序列,设计扩增NA基因的特异性引物,通过RTPCR技术扩增5株H6N1亚型禽流感病毒NA基因序列,并将其克隆到pMD18-T载体后进行了测序分析.同时通过生物学软件对5株禽流感病毒NA基因进行了分析研究.结果表明:5株禽流感病毒NA基因全长1 410 bp,编码47...     

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

野鸡源H9N2亚型禽流感病毒NA基因的序列分析

通过病毒RNA抽提、RT-PCR、克隆，试验一次性获得野鸡源禽流感病毒A／Pheasant／Guangdong／GZI／2003（H9N2）NA全基因．序列分析及联机检索表明，该病毒的NA基因由1458bp组成，其中开放阅读框（ORF）l401bp编码466个氨基酸；ORF与A／Chicken／Guangdong／11／97同源性最高，达98％；与A／Chicken／Guangdong／11／97的NA亲缘性最近．     

一步法多重RT-PCR禽流感病毒分型诊断法的建立与应用

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)均未扩增出特异性基因条带,;灵敏度高,试验组将AIV接种SPF鸡胚,培养后的鸡胚尿囊液(AAF)进行10-2稀释后,仍可以检测到其中的AIV。     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律：[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（}19N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株删基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分剐与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株进行比较分析,[结果]获得了4个毒株圳基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10O个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82．6％～95．1％、83．O％～99．0％、82．7％～95．5％、81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．O％～97．1％、86．9％～97．3．[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性.     

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。