鹿茸顶端组织IGF1R基因的部分cDNA克隆及差异表达

为了研究梅花鹿鹿茸顶端组织IGF1R基因的表达水平,采用TRIzoL试剂分别提取鹿茸真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层总RNA,以逆转录酶AMV反转录合成cDNA,根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGF1R基因特异引物并克隆IGF1R基因,最后利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGF1R基因在...     

东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库构建及IGF2基因克隆与结构分析

 【目的】从功能基因组学角度深入研究鹿茸软骨组织生长发育机理,探讨胰岛素样生长因子-II（IGF2）在鹿茸软骨组织生长发育过程中的作用。【方法】利用SMART技术构建了东北马鹿鹿茸软骨组织全长cDNA文库,并设计IGF2基因保守引物对该文库进行筛选。【结果】构建的未扩增文库滴度为1.8×106 pfu•ml-1,文库重组率大于89.8%;插入片段平均长度约为1.2 kb;扩增文库滴度为1.4×1010 pfu•ml-1;克隆东北马鹿IGF2基因（GenBank登录号：EF177491）CDS区为540 bp,编码179 aa长度的多肽,与GenBank中检索得到的猪、马、牛、羊、人、小鼠和大鼠IGF2基因进行比对分析显示,马鹿IGF2多肽无色氨酸（Trp）,组氨酸（His）与苏氨酸（Thr）含量在8个物种中最高;重建系统树结果显示,东北马鹿IGF2与牛和羊IGF2基因具有最高的相似性。【结论】成功构建东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库并克隆到IGF2基因。     

梅花鹿成熟型TGF-β1基因的克隆与结构分析及其在鹿茸顶端组织中的表达

为探究细胞因子对鹿茸再生的影响,提取鹿茸顶端组织总RNA(Trizol法),反转录获得cDNA模板,克隆TGF-β1成熟肽基因。利用生物信息学软件,对其基因序列及蛋白质结构进行分析。结果表明:成功获得梅花鹿TGF-β1成熟肽基因,序列长339 bp,共编码112个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为12.8 kD。同源性分析结果显示,TGF-β1在进化过程中具有高度保守性,梅花鹿与牛、羊、猪、人、鼠的核苷酸序列同源性均90%;除鼠外,梅花鹿与其他物种氨基酸序列并未发生变化。免疫组化结果显示,TGF-β1在鹿茸顶端不同组织中差异表达,软骨层中表达水平最高。由此推测,TGF-β1在鹿茸再生过程中可能发挥重要作用。     

microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响

【目的】构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1基因(IGF1)的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响。【方法】根据IGF1mRNA序列设计并合成4对premicroRNA前体片段,定向克隆于pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-4;测序分析插入序列的完整性,将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1蛋白的表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响。【结果】测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确。转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1mRNA的表达水平均有所下降,其中转染重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,因而筛选重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2为最佳干扰质粒。与对照组相比,IGF1蛋白的表达水平降低;重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期。【结论】梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中,miRNA具有重要的调控作用。     

MiRNA－93－5p 对 VEGF 的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系1）

为了探讨miRNA－93－5p对梅花鹿血管内皮生长因子（ VEGF）的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,分离了鹿茸顶端软骨组织细胞,利用Trizol试剂法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿VEGF基因的3′端非编码区部分序列（3′UTR）特异引物并进行克隆,构建VEGF基因的3′UTR野生型及其突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测。再将人工合成的miRNA－93－5p模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测鹿茸细胞体外增殖的变化;Western blotting分析VEGF蛋白的表达丰度。结果表明：成功获得了鹿茸组织VEGF基因的3′UTR序列,野生型序列长度为356 bp,突变体长度为336 bp。荧光素酶活性检测结果表明,转染野生型质粒组细胞荧光素酶活性降低,而转染突变体组细胞荧光素酶活性无明显变化。 MTT法和Western blotting结果显示,鹿茸细胞的体外增殖受到抑制,VEGF蛋白的表达水平下降,且呈时间依赖性。     

IGF1对生长30d鹿茸的体外培养鹿茸生长中心干细胞的影响

【研究目的】利用细胞培养技术，探讨胰岛素样生长因子（IGF1）对生长30d的鹿茸体外培养不同代数梅花鹿鹿茸生长中心干细胞（鹿茸干细胞）的影响；【方法】原代分离、培养生长30d的鹿茸的梅花鹿鹿茸干细胞．将第2代、5代、8代鹿茸干细胞经含有不同浓度的IGF1（0，1，3，和10nM）作用后，在培养24h后用3H．胸腺嘧啶核苷测定法检测每分钟衰变数（DPM）值；【结果】取材于生长30d鹿茸的干细胞，全部IGF1处理组（1，3，10nM）都显著高于对照组（0nM）（p〈0．01）。3个不同浓度IGFI处理组的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最低（分别为2987和3743DPM／mg蛋白），而培养5代的细胞最高（分别为10320和12180DPM／mg蛋白）．第8代的细胞又开始下降（分别为8754和11568 DPM／mg蛋白）；【结论】IGF1能够促进鹿茸干细胞分裂增殖，生长30d鹿茸的干细胞在离体培养，不同培养时期的鹿茸干细胞对IGF1刺激的敏感度不同。     

鹿茸顶端组织GHR基因的cDNA克隆及组织定位

【目的】检测鹿茸顶端组织GHR基因的表达,为鹿茸再生的分子机理研究提供理论依据。【方法】根据GenBank已发表的牛、山羊和绵羊生长激素受体(GHR)基因序列,用CLUSTAL W软件进行同源性分析,在保守序列设计克隆鹿GHR基因编码序列的引物。以3~4岁健康鹿生长30 d的鹿茸顶端组织提取的总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆GHR基因的cDNA序列;并用原位杂交技术对GHR基因在鹿茸顶端进行组织定位。【结果】成功克隆到了1 967 bp的序列(GenBank登陆号为EU381142),该序列包含GHR基因的全部编码序列。鹿GHR基因与牛、羊、人GHR核苷酸同源性分别为97%,97%和80%,GHR蛋白氨基酸序列同源性分别为97.9%,97.6%和77.3%。杂交结果显示,在皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层的阳性组均有蓝色杂交信号。【结论】利用RT-PCR技术和原位杂交技术在鹿茸顶端皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层均检测到GHR的表达。     

梅花鹿VEGF基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了得到VEGF成熟肽基因,利用Trizol试剂法提取鹿茸顶端组织总RNA,反转录形成c DNA。根据Gen Bank已发表的相关基因序列设计1对特异性引物,并克隆VEGF成熟肽基因,再利用免疫组化法检测VEGF基因在鹿茸顶端不同组织的表达水平。结果表明:成功获得梅花鹿VEGF成熟肽基因,该基因长495 bp,共编码164个氨基酸;经Blast同源性分析,结果显示与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.79%、97.98%、96.36%;经DNAMAN软件比对,其氨基酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%。免疫组化法结果显示,VEGF在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,其中在软骨层中表达水平较高。     

鹿科动物茸角组织Osteopontin基因全长cDNA的克隆及表达分析

骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是在骨基质的矿化和吸收过程中起重要作用的细胞因子,研究首次从梅花鹿鹿茸尖端组织cDNA文库中成功克隆了OPN基因的全长cDNA序列,并结合生物信息学方法和实时荧光定量RT-PCR技术对该基因的氨基酸序列及表达特征进行分析。结果表明,OPN的cDNA全长为1 406 bp,编码279个氨基酸。经生物信息学分析,该基因为不稳定蛋白,具有N端信号肽,相对分子质量为30.99 ku,理论等电点为4.40,其一级结构中丝氨酸和谷氨酸残基所占比例最高,含有特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD)。同源序列比对及系统进化树分析表明,鹿源OPN氨基酸序列不仅与欧洲牛和山羊相似性最高(分别为86%,85%),且在该基因座位上也与二者在亲缘关系最近。实时荧光定量RT-PCR分析表明,OPN基因在鹿茸尖端不同组织层的表达存在差异,前软骨层和软骨层的表达量普遍高于间充质和皮肤层,推测OPN可能通过介导破骨细胞与矿化组织的黏附,从而参与了鹿茸组织的矿化。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型胶原的克隆和序列分析

型胶原是肥大软骨细胞的标志物,据GenBank中收录的人、鼠、牛、猪型胶原基因的序列,进行同源性分析,在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培养方法,培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA,以总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的型胶原基因序列为877的片段,此片段全部位于编码区,与已报道的牛的型胶原基因的序列比较,同源性达到96%。共有35个碱基发生变异。DNAStar软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为95.5%。     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

梅花鹿KGF的基因克隆及在不同时期顶端茸皮组织的表达分析

为分析梅花鹿KGF基因的生物学特性及其在鹿茸生长不同阶段顶端茸皮组织的表达差异,以雄性梅花鹿茸皮组织为试验材料克隆梅花鹿KGF基因,并采用荧光定量PCR技术对KGF基因在梅花鹿鹿茸顶端不同生长阶段的茸皮组织中的表达量进行差异分析。结果表明:1)成功克隆获得梅花鹿KGF基因的完整编码区,全长为585 bp,共编码194个氨基酸;KGF基因编码的蛋白质是具有跨膜结构的不稳定的亲水蛋白,其相对分子质量为22 489.17,理论等电点pI为9.35;二级结构以无规则卷曲为主;2)通过Blastp功能比对显示梅花鹿KGF基因与马鹿、白尾鹿、牛、野牛、山羊的相似性均在99%以上;3)荧光定量PCR结果显示,KGF基因的表达量在梅花鹿鹿茸前期与中期、前期与后期的顶端茸皮组织中差异显著(P<0.05),其在中期的表达量是前期的(2.158 5±0.014 1)倍,后期的表达量是前期的(1.728 5±0.225 3)倍;其表达量在中期与后期差异不显著(P>0.05)。综上,本研究发现梅花鹿KGF基因在进化中的保守性较高,对鹿茸的生长发育与组织修复有重要作用,其在不同时期茸皮组织中的相对表达量存在差异。本研究为进一步探索鹿茸生长的分子机理奠定基础,为哺乳动物的组织创伤修复提供参考。     

梅花鹿TGF-β1基因的克隆及序列分析

从梅花鹿的鹿茸血中提取总DNA,经PCR扩增后,对梅花鹿的TGF-61基因部分片段进行了克隆测序,序列长度为839 bp,现已将该序列提交到Gene Bank上.Gene Bank中的Blast分析表明,梅花鹿TGF-β1基因与牛同源性为92%,与羊同源性为94%.     

微切变－助剂互作技术制备鹿角盘微切助粉及其活性物质的检测

[目的]检测鹿角盘微切助粉中与骨质疏松症有关的活性物质的含量。[方法]采用微切变-助剂互作技术制备鹿角盘微切助粉,通过与中药粉碎技术相比,考察该技术对鹿角盘颗粒粒径、形态的影响并检测其中活性成分的含量。[结果]经微切变-助剂互作技术处理后,鹿角盘粒径在1~30μm范围内的颗粒数占82.73%,且细胞已被充分破碎,有效成分呈释放的状态。鹿角盘微切助粉中含有丰富的性激素(包括雌二醇、睾酮、孕酮)、类胰岛素样生长因子-1、柠檬酸钙和钙,且含量均高于其粗粉组,说明微切变-助剂互作技术有利于鹿角盘中活性成分的释放,体现了该技术的优越性。[结论]该研究可为合理开发利用鹿角盘提供一种新的粉碎技术,并为阐明鹿角盘防治骨质疏松症提供理论依据。     

再生茸生长剂对马鹿增茸效果的观察

对５１只马鹿进行再生茸生长剂增茸试验，结果试验组３４只鹿１００％长出再生茸，对照组只有２３．５％长出再生茸，试验组比对照组平均增产０．６１３ｋｇ，增增１３．９３倍，平均增收８９．００元；以３３只马鹿进行再生茸生长剂与ＣＡ增茸素的对比试验，再组均１００％长出再生茸，平均产量分别为１．１９６ｋｇ和１．１３４ｋｇ，无显著差异。     

新疆军垦型细毛羊MHC基因临近区段3个遗传标记的研究

比较基因组学是基因组学的重要分支,现已成研究生物基因组的最重要的策略与手段.研究发现绵羊与牛及山羊之间基因组序列的同源性或同线性程度要高于其他物种,能利用牛和山羊的基因组研究结果进行比较基因组学研究,进而阐明绵羊的基因组功能.试验采用琼脂糖凝胶电泳技术,对新疆军垦型细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB_EX2、MCMA36、CP73 三个分子标记分别进行了PCR产物的检测、测序和同源性比对.结果表明,这3个序列均与相关物种的对应序列具有很高的同源性:DMB_EX2与牛的对应序列的同源性为89;,MCMA36与山羊的对应序列的同源性为97;,CP73与羊的对应序列的同源性为96;.     

东北梅花鹿茸不同部位多糖与无机元素质量分数的差异

选取10支东北梅花鹿茸,分别从顶部、上部、中部和基部分腊片、粉片、血片和骨片部位进行取样,对各部位的多糖与无机元素质量分数进行了比较分析。结果表明:各部位间多糖与无机元素质量分数差异极显著或显著。从腊片到骨片部位,多糖、钾和钠的质量分数逐渐降低,钙、磷、镁的质量分数逐渐升高。微量元素铜、锌、铁和锰的质量分数离散性大,无规律性。多糖与钾、钠、钙、磷和、镁质量分数变化的规律性可以作为评价东北梅花鹿茸的内在指标。     

绵羊NICD基因的克隆、真核表达及其序列分析

采用RT-PCR技术扩增绵羊Notch基因胞内段功能结构域(NICD),将其克隆到慢病毒表达载体中,在293T细胞中对其进行真核表达,通过Western blotting鉴定其蛋白表达,进一步对NICD核酸和氨基酸序列进行分析。结果表明,首次克隆获得绵羊NICD基因,该基因序列为2 388bp(GenBank登录号为KF318190.1),编码795个氨基酸,重组蛋白分子质量为110ku左右。序列分析结果显示,核酸序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和83%,进化上与牛的关系最近;蛋白序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和84%,预测二级结构可能存在26个α-螺旋、13个β-折叠、66个转角和64个无规则卷曲。