利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原

[目的]利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原。[方法]利用阴离子交换树脂制备高纯度的FMDV抗原,通过对样品及缓冲液pH、流速、缓冲液的盐浓度、样品上样体积等条件的摸索,确定最佳的FMDV抗原洗脱条件。[结果]当缓冲液pH为8.0、流速1.2 m L/min、盐浓度450 mmol/L、上样体积1.5 m L时,FMDV抗原的纯化效果最佳。[结论]该研究结果可为离子交换层析在FMDV抗原的分离与纯化提供依据。     

短小芽孢杆菌阿魏酸酯酶的分离纯化及性质研究

通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析,对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)发酵液中的阿魏酸酯酶进行分离纯化,并测定其部分酶学性质。结果表明,阿魏酸酯酶的纯化倍数为5.06,回收率达到14.8%。该酶的相对分子质量约为28.6 ku;最适反应温度为50℃,最适pH为5.8,在40~45℃和pH 5.8~8.2都能保持很高的稳定性。K~+、Co~(2+)、Ca~(2+)和DTT对酶活有明显的促进作用,而Cu~(2+)、乙醇和苯甲基磺酰氟严重抑制了其酶活。以阿魏酸甲酯为底物,测得Km为0.25 mmol/L,Vmax为6.27 U/(min·mg)。     

离子交换层析法纯化羊血SOD及其稳定性研究

以羊血为原料,通过热处理、透析、离子交换层析等方法获得SOD提取物,测定其酶活力和蛋白质含量,并从温度、pH稳定性和外源试剂耐受性等几个方面对SOD稳定性进行了研究.结果表明:经过离子交换层析后,SOD的比活力达到5289.1U·mg-1,回收率为60%,纯化倍数为25.3倍;在40～60℃保温30min,SOD酶活力基本不变;pH6～9范围内SOD的稳定性较好;SOD对2mmol·L-1H2O2和尿素较敏感,2mmol·L-1SDS对SOD没有明显的抑制作用.     

一株枯草芽孢杆菌环状糊精葡糖基转移酶的提取、纯化和性质

枯草芽孢杆菌SC3-2是一株高产环状糊精葡糖基转移酶(CGTase)的菌株,将其发酵液通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-纤维素(DEAE-cellulose-52)离子交换层析和Sephadex S-200凝胶层析进行纯化。经过几步纯化后CGTase比活力达到4 923 U/mg,纯化倍数达11.37倍,回收率为20%。通过对酶性质的测定,结果表明:在pH6.5,30℃条件下,菌种产酶量最高;在pH5.5~7.5,40℃以内该酶较为稳定;Mn2+和Ca2+对酶活具有一定的促进作用;EDTA、Na+、Fe3+、Cr3+、Zn2+、Cu2+对酶活影响不大;SDS、Ag+和Hg+使酶几乎失去活性。本研究为环状糊精葡糖基转移酶的应用提供了依据。     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶的快速分离纯化

将人胎盘组织粗匀浆、超速离心、GSH-Sepharose6B亲和纯化,再经DEAE52纤维素离子交换层析,分离纯化了人胎盘谷胱甘肽S-转移酶(GST-π).纯化的酶比活力为66.94 μmol*min-1*mg-1,纯化倍数为515倍,人GST-π的最适pH值为7.5;冷冻干燥后,在-20℃可保存1年.体外实验表明,酶在37℃保温90 min,酶活性下降80%.     

人白细胞介素-12的纯化及鉴定

[目的]利用人白细胞介素-12(human interleukin 12,hIL-12)转基因马铃薯,探讨hIL-12的纯化条件.[方法]提取转基因马铃薯中的总蛋白,hIL-12的分离纯化步骤包括超滤、MKF-AIW阴离子交换层析、MKF-CIC阳离子交换层析.在阴离子交换层析吸附过程中采用试管法选择最佳吸附pH值,选择洗脱过程最佳洗脱pH值;选择阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值;ELISA法测定各纯化阶段收集的上清液或洗脱峰中的hIL-12的含量;非还原SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;Western Blot检测纯化的hIL-12.[结果]阴离子交换层析吸附过程最佳吸附pH值为7.5,洗脱过程最佳洗脱pH值为7,阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值为6.5.纯化的hIL-12经非还原SDS-PAGE分析蛋白纯度为91%.Western Blot分析结果表明,在40 kD处有特异的蛋白条带出现.[结论]hIL-12转基因马铃薯经总蛋白提取,超滤,阴离子交换层析,阳离子交换层析纯化,获得了高纯度的hIL-12.     

金针菇菌糠中木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

废弃食用菌栽培料(SMC)中含有一定活性的木聚糖酶,作者以金针菇菌糠为材料,采用盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE C-52离子交换层析等技术,对SMC中的木聚糖酶进行分离和纯化,并进行酶学性质研究。结果表明,该酶经SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,分子量为37.8 KDa,酶比活力达到946.67 U/mg,纯化倍数为12.74;酶的最适温度和pH分别为50℃和pH 6.0,Fe~(2+)、Zn~(2+)对木聚糖酶有激活作用,Ca~(2+)、Mn~(2+)、K~+有促进作用,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)有抑制作用,反应动力学参数V_(max)和K_m分别为15.43μg/mL/min、9.61 mg/mL。     

珊瑚藻藻红蛋白分离纯化技术及光谱学特性

藻红蛋白(PE)具有特征性吸收光谱和荧光光谱,是一种新颖的荧光分子探针.经反复探索研究建立了盐析、离子交换层析、羟基磷灰石吸附层析和凝胶过滤层析的分离纯化方案,从珊瑚藻中分离纯化出R-藻红蛋白(R-PE),其纯度[D(565nm)/D(280nm)]高达11.     

双液相萃取离子交换层析法纯化猪硫酸软骨

采用聚乙二醇(PEG)/硫酸铵双液相萃取-离子层析法纯化猪硫酸软骨素,红外光谱法测定结构,咔唑分光光度法测定含量.以PEG的相对分子质量和质量分数、(NH4)2SO4的质量分数、pH值和萃取次数为考察因素,以猪硫酸软骨素的回收率和纯度为考察指标,正交设计法优化双液相萃取条件.IRC50离子交换树脂对萃取液纯化,红外光谱法和咔唑分光光度法鉴定纯化后猪硫酸软骨素的含量和结构.最佳纯化条件为:PEG相对分子量为4 000,质量分数为30%,(NH4)2SO4的质量分数为26%,pH值为10,萃取3次.萃取样品经IRC50离子交换树脂纯化后,质量浓度在0～250mg/L范围内线性关系良好,相关系数r=0.999 7,样品含量为90.49%,相对标准偏差为0.58%.红外吸收光谱比较纯化后猪硫酸软骨素和标准品硫酸软骨素-A,其特征吸收峰均在3 400,1 620,1 560,1 240,860cm-1处.该方法精确度和准确度都较高,可用于猪硫酸软骨素的纯化.     

毕赤酵母工程菌原果胶酶的分离纯化

采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤和离子交换层析等方法,对毕赤酵母工程菌发酵液中的原果胶酶进行了分离纯化,测定了其分子质量,并确定了离子交换层析法的最佳离子交换条件。结果表明,硫酸铵的饱和度为70%时,可以使原果胶酶的回收率达到71.9%,比活力为1 096.35 U/m g;经Sephadex G 75凝胶过滤,原果胶酶回收率达到57.6%,酶的比活力提高到3 762.40 U/m g;最佳离子交换条件为:0~0.5 m o l/L N aC l(缓冲体系为N oA c-HA c,pH 5.8)溶液线性洗脱、Sepharose F ast F low离子交换层析分离,在该条件下酶的比活力提高到9 743.20 U/m g,纯度为粗酶液的18.91倍,达到了电泳级;SDS-PAGE电泳结果表明,其分子质量为43.17 ku。     

三步层析法分离毕赤酵母工程菌中表达的新疆家蚕抗菌肽

通过离子交换层析、疏水作用层析和分子排阻层析等三步层析的方法,分离纯化了毕赤酵母工程菌所表达的新疆家蚕抗菌肽.结果表明,三步层析后,SDS电泳显示单一条带,分子量约为7.0 kDa;所纯化的新疆家蚕抗菌肽具有较强的抗菌活性.该纯化工艺的建立,为新疆家蚕抗菌肽在饲料添加剂、农用抗生素等方面的广泛应用奠定基础.     

侧孢短芽孢杆菌S62-9产抗菌物质的分离纯化及部分特性的研究

为开发新型天然抗菌物质,本研究采用硫酸铵盐析、DEAE-cellulose 52离子交换层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤对侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9产的抗菌物质进行分离纯化,并对其部分特性进行研究。结果表明:该抗菌物质对热和pH值稳定性高,且抑菌谱广,可抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,显示出该抗菌物质具有良好的应用前景。     

人白细胞介素-12的纯化及鉴定

[目的]利用人白细胞介素-12(human interleukin 12,hIL-12)转基因马铃薯,探讨hIL-12的纯化条件。[方法]提取转基因马铃薯中的总蛋白,hIL-12的分离纯化步骤包括超滤、MKF-AIW阴离子交换层析、MKF-CIC阳离子交换层析。在阴离子交换层析吸附过程中采用试管法选择最佳吸附pH值,选择洗脱过程最佳洗脱pH值;选择阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值;ELISA法测定各纯化阶段收集的上清液或洗脱峰中的hIL-12的含量;非还原SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;Western Blot检测纯化的hIL-12。[结果]阴离子交换层析吸附过程最佳吸附pH值为7.5,洗脱过程最佳洗脱pH值为7,阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值为6.5。纯化的hIL-12经非还原SDS-PAGE分析蛋白纯度为91%。Western Blot分析结果表明,在40 kD处有特异的蛋白条带出现。[结论]hIL-12转基因马铃薯经总蛋白提取,超滤,阴离子交换层析,阳离子交换层析纯化,获得了高纯度的hIL-12。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价

为提高原核表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白纯度,在大肠杆菌中表达VP2蛋白,并对其进行纯化方法优化及其免疫原性分析。利用琼脂扩散试验(AGP)测定VP2蛋白效价并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;采用饱和硫酸铵溶液和离子交换层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化填料、洗脱液离子强度及缓冲液的pH值进行优化,以确定最佳纯化条件。将纯化的VP2蛋白免疫SPF鸡,定期采血用ELISA方法测定其免疫抗体并进行病理组织检测。SDS-PAGE及Western blot鉴定结果显示,VP2分子质量约为50 ku,且具有良好反应原性,VP2蛋白可溶性表达的AGP效价为1∶16。纯化结果显示,利用强阴离子层析优化盐离子浓度及pH值可获得纯度较高的VP2蛋白,其质量浓度为0.6 mg/mL。纯化的VP2蛋白加商业佐剂免疫鸡28 d后,鸡产生的特异性免疫抗体滴度最高,且攻毒后的保护率可达到80%,法氏囊无明显病理组织损伤。综上,利用大肠杆菌成功表达了VP2蛋白,纯化的VP2蛋白纯度较高且具有良好的免疫原性。     

枯草芽孢杆菌MN菌株由来胶原蛋白酶的纯化与生化性质

从传统小麦粉发酵食品中分离得到一株革兰氏阳性且为兼性需氧的内生芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌MN菌株,该菌能产生胶原蛋白酶,其16S核糖体核酸序列与枯草芽孢杆菌显示99%的同源性.通过一系列的离子交换层析与分子筛层析,该菌分泌产生的胶原蛋白酶被分离纯化到单一条带,通过分子筛层析预测该胶原蛋白酶的分子量为33 kDa,其活性最适反应温度与酸碱度分别为55℃和pH 11.0,而且该酶的热稳定性与酸碱度稳定性分别为50℃和pH5.0～11.0.     

鸡蛋清中3种蛋白质的连续化提取工艺初步研究

研究鸡蛋清中溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白的分离提取工艺.采用硫酸铵沉淀和离子交换层析分离3种蛋白质,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度.结果显示,层析纯化后SDS-PAGE检测其纯度达到电泳纯,溶菌酶的比活由144.13 U/mg提高到2 235 U/mg,纯化倍数达15倍,回收率为15.76％;卵转铁蛋白抑菌率为48.84％.该方法分离溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白的工艺路线简单、快捷、成本低,适用于工业生产.     

鸭肝蛋白酶的分离纯化及其部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到鸭肝蛋白酶电泳纯制品. 纯化倍数为650.16倍,回收率为19.23%. 经SDS-PAGE和凝胶过滤测得该酶的分子量为35 kD. 该酶在pH 6.0～11.0,温度低于25 ℃稳定,当温度上升到55 ℃时活性迅速下降. 该酶在pH 10和60 ℃时达到最高活性. 进一步研究得知: Cu2+离子对该酶有明显促进作用,而Mn2+却使酶几乎失活. 以酪蛋白为底物,在pH 10.0、37 ℃时测得米氏常数Km值为1.33%.     

三色革裥菌胞外漆酶纯化及部分动力学性质测定

采用两种不同的介质组合对三色革裥菌(Lenzites tricolor)胞外漆酶进行分离纯化,第一种组合方式为:(NH4)2SO4盐析,透析,聚乙二醇(PEG20000)浓缩,SephadexG-150柱层析(1.6cm×60cm),DEAE-Sepha-dexA-25离子交换层析(2.6cm×40cm);第二种组合方式为:(NH4)2SO4盐析、透析、超滤浓缩、DEAE-Sepha-roseFF离子交换层析(1.6cm×60cm)、SephadexG-75凝胶层析(1.6cm×60cm)。测定结果表明,第二种组合方式较高效、合理。该漆酶反应活力最高时温度为60℃、最适pH值为4.6。所测试浓度下,Fe2 、Fe3 、硫脲、叠氮化钠和二硫苏糖醇对漆酶活性有一定抑制作用;Ca2 、乙二氨四乙酸及其二钠盐对漆酶活性具明显的促进作用。氧化丁香醛连氮的米氏常数Km值为43.4μmol/L。     

比较大孔树脂与离子交换填料浓缩纯化FMDV抗原的效果

[目的]确定FMDV抗原的最佳纯化方法及纯化条件,为其在我国动物用疫苗行业中的大规模应用和推广奠定基础。[方法]选用大孔树脂和离子交换填料浓缩纯化FMDV抗原,通过对样品及缓冲液的pH、流速、离子强度、上样量等方面探讨各填料的最佳工作参数,并比较2种方法浓缩纯化同种FMDV抗原的效果。[结果]大孔树脂处理样品的抗原回收率为21%,离子交换填料的抗原回收率为11.7%,均不理想。大孔树脂的杂蛋白去除率为90%,离子交换填料的杂蛋白去除率仅为52%,说明大孔树脂在去除抗原中杂蛋白的效果方面可达到所需的要求。[结论]这2种方法浓缩纯化FMDV抗原的效果均不理想,但大孔树脂效果稍好。     

鸭肝过氧化氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到鸭肝过氧化氢酶电泳纯制品,回收率为18.23%,比活达4 780.38 U/mg,纯化倍数为66.15.最适温度为40℃,最适pH为7.0,该酶在20～40℃,pH 5～8内稳定.经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250 KD,亚基分子量为62.5 KD.