巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

根肿病菌核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

 应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4,对十字花科蔬菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）rDNA进行PCR扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和碱基编码结构特点分析,结果表明:十字花科蔬菜根肿病菌ITS1区长141 bp,5.8 S区长160 bp,ITS2区长187 bp,rDNA总长为488 bp. 根据此序列设计一对根肿病菌特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’AGG TGA ACC TGC GGA AGG AT 3’和后引物:5’TTC AGC GGG TAA TCC TAC CT 3’）,应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术,对分离自十字花科蔬菜（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）根肿病菌全基因组DNA进行特异性扩增试验。试验结果表明,该对引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到约500 bp长度的分子片段,而对照菌株和健康对照则无扩增产物。该实验结果对有效追踪根肿病菌在田间的发生动态监测和预测预报提供了重要的信息和手段。     

三七病原根结线虫核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

根据NCBI基因库中根结线虫属rDNA序列,设计通用引物M18s/M28s,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地的4个三七病原根结线虫种群(Meloidogyne hapla)rDNA区段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和序列分析,结果表明:4个种群rDNA同源性为100%,ITS区序列长度为479 bp,其中ITS1序列长度为213 bp,5.8S序列长度为159 bp,ITS2序列长度为107 bp。根据此序列设计-对特异性寡聚核苷酸引物Mhf/Mhr,应用PCR技术,以北方根结线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和爪哇根结线虫(Meloido-gyne javanica)全基因组DNA为对照,对三七病原根结线虫全基因组DNA进行特异性扩增。结果表明,该对引物能从供试的北方根结线虫和三七病原根结线虫种群全基因组DNA中扩增到462 bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫则无扩增产物。该引物可用于三七病原根结线虫的检测。     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。     

胶胞炭疽菌DNA的PCR特异性扩增

利用1对胶灰疽菌特异寡聚核苷酸引物，对31个来自于橡胶树，芒果树的胶胞炭疽菌菌株的全基因组DNA进行扩增，均扩增到约500bp的DNA片段，而芭蕉炭疽功，辣椒疽菌，菜豆炭疽菌，腐霉菌，镰刀菌则不能被扩增。这表明，通过种间DNA特异片段的PCR扩增，能将胶胞炭疽菌与其他炭疽菌种类区别开来。采用该方法鉴别胶胞炭疽菌，其结果与形态鉴别的相吻合。     

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的快速分子检测

为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。     

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的快速分子检测

为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.     

川续断基因组DNA的提取研究

川续断叶片中很有较多的蛋白质、多糖、酚类以及其他一些次生代谢物,采用传统的CTAB法很难得到高质量的DNA。试验以川续断叶片为材料,提出一种改良的CTAB法提取叶片基因组DNA,对提取的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测及紫外分光光度计分析。利用中药材条形码ITS2序列的引物对提取的基因组DNA进行PCR验证。结果表明,改良的CTAB法得到的DNA质量较好,其OD260/OD280的值介于1.8~2.0之间,ITS2序列的引物PCR扩增成功率达到100%。改良的CTAB法为较为理想的川续断基因组DNA提取方法,获得的总DNA能够满足下游的PCR试验要求。     

一种鸡腿菇病害病原菌的分离及鉴定

从莒县鸡腿菇种植区采集到表现鸡爪症状的样品,分离得到病原菌分离物RZ,采用改良的CTAB法提取其基因组总DNA,利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增其rDNA ITS区域序列,扩增产物纯化克隆后转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆进行测序。将获得的序列进行同源性比对和构建系统进化树,发现RZ分离物与GenBank中Bionectria ochroleuca 2个分离物聚为一簇,ITS的核苷酸一致率均为99.17%,从分子水平上证明该分离物为淡色生赤壳菌(B.ochroleuca)。     

香蕉枯萎病镰刀菌ITS序列的PCR扩增及其分子检测

根据香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)ITS序列设计合成的三条引物:FusF1(5′AACCC CTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)构成引物对A(FusF1/R1)和B(Fus F1/R2),对尖廉孢菌古巴专化型病菌进行PCR特异扩增试验,结果表明,两对引物对引起香蕉枯萎病的镰刀菌全基因组DNA分别有338bp和408bp的特异扩增产物;在镰刀菌种以上的阶元有较好的分辨力;对目标菌株的检测下限分别是A(100fg)、B(10pg);而且B对香蕉感染枯萎病的病组织有相应的扩增产物,表明该引物对可用于香蕉枯萎病的早期鉴定和病原菌的检测。     

尖刀镰刀孢病原菌ITS和5.8SrDNA的PCR鉴定

通过对ITS/5.8SrDNA区域的PCR和巢式PCR扩增检测真菌DNA,同时评估了PCR和巢式PCR技术的敏感性和特异性。证实了通过PCR和巢式PCR扩增不同种真菌菌株ITS/5.8SrDNA的可行性,通过PCR产物的测序及GenBank比对,能成功检测出该真菌菌株。说明通过对真菌ITS/5.8SrDNA区域的扩增是一种快速检测真菌的方法。     

白木香rDNA ITS序列测序鉴定的初步研究

以改良的CTAB法提取白木香的基因组DNA,运用通用引物对其rDNA的ITS区进行PCR扩增,并对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序。结果表明,白木香rDNA的ITS区序列存在稳定而又明显的差异,白木香rDNA序列差异可能主要集中在ITS1区,存在5处变异位点,ITS2区存在1处变异位点。     

应用特异PCR方法诊断2例猪弓形虫病

[目的]应用特异PCR方法诊断猪弓形虫病。[方法]分别以弓形虫核糖体DNA第一内部转录间隔区(ITS1)序列和529 bp重复序列为目的片段,扩增2例疑似猪弓形虫病的病料肺门淋巴结DNA,对疑似猪弓形虫病的病料进行PCR诊断。[结果]2对引物均能分别扩增出2例肺门淋巴结中弓形虫DNA的特异条带。[结论]基于2种扩增片段的PCR方法均具有较高的特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法。     

适用于rDNA ITS分析的兰属菌根真菌培养及DNA提取方法

为探讨兰属植物与其共生真菌之间专一性关系,采用覆盖纤维素滤膜于PDA培养基的方法培养兰属菌根真菌,提取其DNA后用于rDNA ITS分析。在培养过程中克服PDA液体培养及固体培养获得菌丝体少的缺点,操作方便,获得大量菌丝体;采用改进的提取植物基因组DNA的SDS方法提取真菌的DNA,通过提高缓冲液的pH值、增加EDTA的浓度以提高DNA的提取效果。结果表明,此培养方法及改进的DNA提取方法均简便易行,提取的DNA产量高、质量较好;可满足菌根真菌rDNA ITS分析的要求。     

番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS-PCR扩增条件的优化

探索一种简单、快速的获得番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS目的片断的方法。采用改良的Rodrigues组织培养表面消毒技术和CTAB法提取植物样品总DNA,利用真核生物通用引物LH2/Sm73扩增rDNA ITS目的片段,正交法优选ITS-PCR扩增条件。PCR反应可同时获得两条600 bp和700 bp产物,分别为植物和内生真菌的rDNA ITS目的片断。改良的组织表面消毒技术可排除外源DNA污染。正交法可快速获得植物内生真菌目的片断。该法简单、快速,为番荔枝科植物内生真菌生物多样性研究提供分子生物学基础。     

贵州苗药头花蓼rDNA ITS序列分析

以改良CTAB法提取头花蓼的基因组DNA,采用通用引物对不同来源头花蓼的rDNA ITS 序列进行PCR 扩增,测序 和聚类分析。结果表明,不同来源头花蓼有13 处变异位点,序列长度变异范围为661-666 bp,序列差异主要集中在ITS1 区与ITS2区。rDNA ITS 序列可作为分子水平鉴定头花蓼的参考依据。     

成熟石榴叶片DNA提取方法研究

[目的]为了从成熟石榴叶片中提取高质量、高产量的基因组DNA。[方法]针对成熟石榴叶片含多糖、多酚的特性,用改良CTABI及改良CTABⅡ法分别提取2个品种（墨石榴和青皮软籽石榴）的成熟石榴鲜叶、冻叶、干叶基因组DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、酶切鉴定。【结果]改良CrABⅡ法提取的基因组DNA电泳时点样孔干净,无拖带,OD260nm／OD280nm为1．7—1．9,酶切完全,其质量、产量都高于改良CTABI法。[结论]改良CTABⅡ法是提取成熟石榴叶片中高质量、高产量基因组DNA的有效方法。     

高良姜与混淆品大高良姜的rDNA ITS区序列分析

利用改良的CTAB法提取药材的基因组DNA,运用通用引物对高良姜及混淆品大高良姜rDNAITS区进行PCR扩增,对产物进行直接测序并对测序结果进行聚类分析。结果表明,经ClustalX软件序列比对后发现二者ITS的长度范围在568～576bp,有32处变异位点,主要集中在ITS1区和ITS2区,聚类分析表明高良姜与大高良姜各聚为一支,表明高良姜与大高良姜两种植物碱基序列有较大的差异。     

珠海淇澳岛4种红树植物ITS区段的序列测定

以改良的CTAB法提取珠海淇澳岛4种红树植物的总DNA,使用通用引物分别对其ITS区段的序列进行PCR扩增及测序,并对所测序列进行比对分析.结果表明,桐花树、木榄、杨叶肖槿和海漆的ITS1长度分别为404、362、460、439 bp;ITS2长度分别为219、208、231、226 bp;将4种红树植物ITS区段的序列测定结果提交到GenBank,获得了登录号.