重组人溶菌酶体外抑菌活性研究

以购买商品化的溶菌酶标准品作为对照,通过平板扩散法检测重组人溶菌酶(rhLYZ)在体外对几株致病菌及益生菌的抑菌作用,同时用梯度稀释法检测重组人溶菌酶的MIC和MBC。分别将重组酶和商品酶做梯度稀释后,滴加到涂布有一定量菌液的MH平板,通过平板扩散法测量各组抑菌环直径大小,从而判定其抑菌活性。结果表明,重组人溶菌酶抑菌活性显著高于标准溶菌酶,低质量浓度的重组酶即可对致病菌的生长产生抑制和杀灭作用。rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌较为敏感,抑菌环直径达到15mm～18mm;对多杀性巴氏杆菌抑菌环直径则达到27.5mm。提示rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌及多杀性巴氏杆菌等病原菌均具有较强抑菌活性。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

喷雾干燥对人溶菌酶转基因山羊乳汁的影响

【目的】揭示奶粉制备过程对转基因山羊乳汁中表达的重组人溶菌酶(recombinant human lysozyme,rhLYZ)的影响。【方法】对表达有2mg/mL rhLYZ的转基因山羊乳汁进行了喷雾干燥,对获得的奶粉样品进行了溶解性,乳汁成分,蛋白组分以及溶菌酶活性的测定,对测定结果进行统计分析。【结果】喷雾干燥引发非脂固形物的损失率为42.05%;整个热处理过程引发可溶性蛋白损失率为25.3%;乳汁中rhLYZ的损失为51.1%,扣除总干物质的损耗,喷雾干燥过程引发了约17.7%的rhLYZ生物学活性损失。【结论】制备奶粉过程对转基因山羊乳汁中表达的人溶菌酶影响较小,喷雾干燥是人溶菌酶羊奶的一种可行的保存和加工方式。     

鸡源大肠杆菌与人源大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白同源性比较

应用DNA-Star分析软件对3个不同血清型鸡源大肠杆菌YR10(O18)、MG10(O11)及GL7(O78)与人源大肠杆菌(pSH2)Ⅰ型菌毛蛋白结构基因(pilA)序列、氨基酸序列、二级结构及抗原决定簇进行了比较分析。结果表明,鸡源与人源大肠杆菌结构基因序列相似性为:GL7(O78)对pSH2为88.9%;YR10(O18)对pSH2为92.3%;MG10(O11)对pSH2为98.3%。氨基酸序列相似性为:GL7(O78)对pSH2为90.2%;YR10(O18)对pSH2为95.1%;MG10(O11)对pSH2为98.9%。可见,3个菌株Ⅰ型菌毛蛋白的二级结构及抗原表位与人源存在较多的相似性。     

人重组溶菌酶对肉鸡营养消化及肠道组织结构的影响

研究人重组溶菌酶对肉鸡营养消化及肠道组织结构的影响,探讨其替代抗生素的可能性及其在肉鸡日粮中添加的最佳剂量。结果表明,添加0.2%人重组溶菌酶的促生长效果最好。     

人源弹性蛋白酶基因原核载体构建及表达

从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中.然后用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对重组质粒pGEM-T easy/ELA2B和大肠杆菌E.coli表达质粒pET30a进行双酶切,成功构建了原核表达载体pET30a/ELA2B.将重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21中,通过PCR和表型鉴定表明,ELA2B基因已经整合到大肠杆菌BL21染色体上.用IPTG对重组的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到的蛋白经SDS-PAGE分析结果表明:菌体中含有一明显特异性蛋白,大小为28 kD.经包涵体复性后在弹性蛋白酶活性检测平板上发现有代表弹性蛋白酶作用的透明圈产生,可初步证实表达产物具有生物活性.     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白的黏附作用

为研究猪链球菌 2型 (SS2 )的毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)的黏附作用 ,进行了如下试验 :1 用黏附计数法比较菌株HA980 1(MRP+ )和SH0 0 6 4 4 4 (MRP-)的黏附动力学 ,两菌株均能黏附于HEp 2细胞 ,MRP+ 株的最大黏附菌数显著高于MRP+ 株 (P <0 0 5 ) 。 2 菌体置 5 6℃ 1h ,或用胰酶或半乳糖预处理 ,细菌黏附力完全丧失 ;分别用高碘酸、溶菌酶、秋水仙素和DNaseⅠ处理HEp 2细胞 ,前者可完全阻断HA980 1对它的黏附 ,后三者使黏附菌数显著下降。3 用纯化的MRP处理HEp 2细胞 ,或用抗MRP兔血清或MRP的单克隆抗体处理菌体 ,MRP+ 株的黏附菌数显著降低(P <0 0 5 ) ,但不能被完全抑制 ;用抗MRP-株全菌兔血清处理菌体 ,也能降低MRP+ 株的黏附菌数。 4 半乳糖或 5 6℃预处理MRP ,使其完全丧失对HA980 1的黏附抑制功能 ,但胰酶、过氧化氢和巯基乙醇的预处理没有明显的影响。结论 :MRP是SS2的一种黏附素 ,半乳糖可阻断其黏附作用     

人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析

根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85 kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的hLYZ cDNA序列的同源性为99%。推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础。     

萝卜CBPs溶菌酶活性的稳定性研究

植物溶茵酶是植物防御体系中的一部分,在植物防卫体系中具有重要作用.萝卜中有2个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白(Chitin-binding proteins,CBPs),分别是CBP1、CBP2组分.为了解CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能,试验研究了CBP1、CBP2溶茵酶组分酶活性的稳定性.结果显示,CBP1、CBP2在pH 5.4、65℃条件下迅速失活,在pH 3.4～10.6、25℃条件下较稳定;CBP1较CBP2对氧化剂H2O2、NaC1O敏感;CBP2较CBP1对木瓜蛋白酶敏感;2个组分对胰蛋白酶均敏感.     

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。     

人源类金属硫蛋白能促进番茄幼苗对锌的积累

金属硫蛋白具有抗辐射、抗氧化和对重金属解毒等功能,对Zn~(2+)具有很强的结合能力,在医药、农业、环境和保健等诸多领域有潜在的应用价值.将花椰菜花叶病毒35S启动子控制的人源类金属硫蛋白基因HsMT1L导入番茄基因组,结果显示,转基因番茄幼苗比野生型材料对Zn~(2+)具有更强的耐受性,并能够富集更多的Zn~(2+)离子.     

萝卜溶菌酶酶制剂配制的研究

采用脱氨再生几丁质凝胶亲和层析法分离纯化得到电泳纯萝卜溶菌酶酶液，研究了一些常用酶制的稳定剂的防腐剂对萝上眩溶菌酶活性的影响，结果表明：ＮａＣｌ对酶有少量的激活作用；ＮａＦ，ＣａＣｌ２，苯甲酸等在不同程度上对酶活性有抑制作用；而乙醇和甘油对该酶活性影响不大。     

人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。     

荧光相图法研究变性蛋白溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的复性过程

[目的]研究了变性体系无还原剂和有还原剂存在时,变性蛋白溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的复性过程。[方法]利用荧光相图法。[结果]当变性体系中无还原剂存在时,变性蛋白溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的复性过程均符合＂四态模型＂;而当变性体系中有还原剂存在时,变性蛋白溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的复性过程均符合＂二态模型＂。当变性体系中无还原剂存在时,蛋白溶菌酶的复性过程较复杂;比较变性和复性过程推测,非还原脲和盐酸胍诱导的蛋白溶菌酶变性及复性过程并不是2个完全可逆的过程,而还原脲和盐酸胍诱导的蛋白溶菌酶变性及复性过程有可能是可逆的。[结论]该研究可为开发合成杀菌谱广、成本低和安全性高的溶菌酶提供帮助。     

大气颗粒物源解析的遗传算法模型的改进

运用MATLAB遗传算法和直接搜索工具箱改进了应用于大气颗粒物源解析的遗传算法模型。引入数据进行算法程序探讨,将模型计算结果用改进的二重源解析法进行了验证。结果显示,改进的遗传算法源解析模型对数据处理快捷、简便,在一定程度上能够解决严重共线性源类问题,解析结果真实可靠。     

检测猪链球菌2型毒力相关蛋白的ELISA法的建立

提纯猪链球菌2型分离株HA9801的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF），制备其抗体。用此抗体建立了Dot-ELISA和间接ELISA检测法。分别以菌株ATCC35246和HA9801为阴性和阳性对照，检测17株猪源链球菌和1株猪链球菌2型人分离株。结果显示，两种ELISA的检测结果一致，MRP和EF的阳性率均为61％（11／18）。     

植物表达重组蛋白的N-糖基化研究进展

分子农业中,植物作为生物反应器生产药用重组蛋白是近十几年来基因工程研究的一大热点。植物具有完整的真核表达系统、重组蛋白通常可以正确组装、折叠和修饰,同时,由于植物表达体系的方便、廉价等优点,利用转基因植物生产药用蛋白的研究迅猛发展,已有100余种蛋白中得到表达,有些已进入商业化生产。但是植物与动物对蛋白的转译后修饰并不是完全保守的,植物是否能够真正“忠实”地表达出实用、可靠的目的蛋白产品已成为备受瞩目的话题,由于大多数药用蛋白都是分泌型蛋白,因此植物表达重组蛋白的N-糖基化成为新的研究热点。笔者对植物表达体系对药用蛋白的N-糖基化修饰途径和人源化改造植物表达重组蛋白的研究进展两个方面加以综述,并对生物反应器的未来发展方向进行了探讨和展望。     

人溶菌酶活性两种检测方法的比较研究

为了比较琼脂平板扩散法和RBB-R染料标记比色法测定溶菌酶活性的灵敏度和可重复性,分别以人溶菌酶标准品建立标准曲线,用两种方法对不同稀释倍数的人溶菌酶进行5次重复测定,并分析测定结果的标准差、变异系数和误差率。结果表明:两种方法测定溶菌酶的灵敏度分别为1.5和0.5μg·mL-1,RBB-R染料法标准差、变异系数、误差率均小于琼脂平板扩散法。用RBB-R染料标记比色法测定的正常鸡蛋清中溶菌酶含量为2.84-4.19mg·mL-1,与报道的相符,说明RBB-R染料标记比色法具有操作简便、定量准确和重复性好等优点,适合大批样品及微量样品的检测。