猪胎儿成纤维细胞APOE基因的差异表达研究

[目的]研究APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中的差异表达。[方法]收集正常传代生长的第1、10、15、20、25、50代猪胎儿成纤维细胞,分别提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术,检测不同代数猪胎儿成纤维细胞中APOE基因的表达。[结果]猪APOE基因在第1代猪胎儿成纤维细胞中表达水平最高,随着细胞代数的增加,表达量逐渐下降,到第50代表达量最低。[结论]APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中有选择性表达的趋势。     

猪胎儿成纤维细胞APOE基因的差异表达研究

[目的]研究APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中的差异表达。[方法]收集正常传代生长的1、10、15、20、25、50代猪胎儿成纤维细胞,分别提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术,检测不同代数猪胎儿成纤维细胞中APOE基因的表达。[结果]猪APOE基因在第1代猪胎儿成纤维细胞中表达水平最高,随着细胞代数的增加,表达量逐渐下降,到第50代表达量为最低。[结论]APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中有选择性表达的趋势。     

猪CTSZ基因的克隆及真核表达载体的构建

组织蛋白酶Z基因(Cathepsin Z gene, CTSZ)是影响猪生长、肉质等性状的一个重要候选基因.本研究以长白猪的背最长肌为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆CTSZ基因CDS序列全长,对该序列进行了生物信息学分析,并构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,通过脂质体介导瞬时转染猪成纤维细胞,30 h后进行荧光表达检测.结果本试验克隆出猪CTSZ基因CDS全序列912 bp,并成功构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,瞬时转染后在猪成纤维细胞中表现为绿色荧光蛋白表达.本试验为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础.     

猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用

【目的】克隆猪L-Myc基因,并在蛋白水平表达的情况下探索其在细胞重编程中的作用,为深入研究猪L-Myc基因替代c-Myc诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）奠定基础。【方法】先通过NCBI序列比对,采用RT-PCR克隆猪L-Myc基因cDNA,生物信息学分析猪L-Myc基因与人和小鼠的同源性,构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1,通过载体转染和免疫印记检测猪L-Myc基因cDNA的蛋白水平表达;再将L-Myc基因装入逆转录病毒载体中,分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞（porcine embryo fibroblast,PEF）,通过形态变化和碱性磷酸酶（AP）染色验证猪L-Myc基因在细胞重编程中的作用。【结果】①获得了1 113 bp的猪L-Myc基因cDNA,编码364个氨基酸,理论分子质量为40 kD;②生物信息学分析显示猪L-Myc基因与人和小鼠高度同源;③免疫印记检测结果说明猪L-Myc基因cDNA能够在蛋白水平表达;④细胞诱导试验和AP染色结果显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc（OSKL）组合诱导的细胞阳性克隆率明显高于Oct4、Sox2和Klf4（OSK）组合的阳性克隆率。【结论】获得了猪L-Myc基因,并且该基因在蛋白水平表达且在细胞重编程过程中起到了重要的作用。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖

利用针对猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CsFV)石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.     

猪胎儿成纤维细胞SOD1基因差异表达研究

 在研究模式生物衰老机制的过程中,发现衰老受某些特定基因的调控。为研究细胞内铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD,SOD1) 在不同代数的猪胎儿成纤维细胞的差异表达,本试验收集正常传代生长的5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70代的猪胎儿成纤维细胞,分别提取细胞总RNA;采用RT-PCR技术,检测不同代数猪胎儿成纤维细胞SOD1的表达。结果表明猪SOD1在第5代猪胎儿成纤维细胞中表达水平最高,随着细胞代数的增加,表达量逐渐下降,到第70代表达量为最低。结果将为进一步揭示细胞衰老的分子机制提供有价值的参考,同时为丰富猪的分子生物学提供新素材。     

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立 及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。     

PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

[目的]建立PIWIL1基因启动子调控的特异性表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制奠定基础。[方法]通过PCR扩增,从猪的全基因组上扩增出PIWIL1基因的启动子。切除猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor的启动子MHC,将其与PIWIL1基因启动子连接,构建成特异性表达Cre重组酶的pPIWIL1-Cre载体。将该载体转染小型猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得阳性克隆进行核移植。[结果]获得2头PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre酶的转基因猪。[结论]成功构建了PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制提供了工具猪。     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。     

猪IL-18在毕赤酵母中分泌表达条件的优化

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中亚克隆出IL-18基因并完成了真核融合表达载体pPIC9K-IL-18的构建和IL-18在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、pH值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18的发酵工艺.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为72 h,甲醇最适浓度为20 g/L,最适pH范围为6.0~8.0,最适接种量1∶1.与单纯甲醇诱导相比,甘油/甲醇诱导后的表达量明显提高.     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

猪转录因子SOX2下游调控蛋白筛选及调控网络建立

SOX2是早期胚胎发育与干细胞多能性维持相关的重要转录因子。从猪孤雌囊胚中克隆获得猪SOX2基因并构建对应过表达体系。通过猪pEF细胞系与PK15细胞系中过表达SOX2基因及qPCR技术,检测89个下游调控候选基因表达情况,建立猪SOX2下游调控网络。结果发现,GATA4、MSC、GSC、FGF4、STELLA、ACACA、FN1、KLF4以及MEK基因在pEF细胞系与PK15细胞系间呈差异性调控表达。BMP4、FGFR2、ACAA2、ACSL3、β-CATENIN、c-MYC、MYST3、GSK3β、ALDH3A2、STAT3、SMAD2、KDM6A、ACADL、PI3K与WDR3基因在两种细胞系中呈同趋势性调控表达;经JASPAR数据库预测发现,WDR3、β-CATENIN、ACAA2、KDM6A、STAT3、ACADL、GSK3β与ALDH3A2基因启动子区域存在高相关性的SOX2蛋白结合位点,推测这些基因受SOX2蛋白直接调控;同时构建针对猪SOX2基因的高效敲除体系。研究结果为建立物种特异性的猪SOX2调控网络提供数据基础。     

猪IL-10的表达及其免疫原性鉴定

为探明原核表达的重组猪IL-10对仔猪的免疫原性,根据GenBank公布的猪IL-10基因序列(登录号:L20001)设计并合成了扩增猪IL-10基因的引物。利用ConA刺激猪外周血淋巴细胞,通过RT-PCR扩增出pmIL-10完整基因及其成熟蛋白基因片段(pmIL-10),分别插入质粒pVAX1和pET32α(+),对猪IL-10基因进行原核与真核表达。利用纯化的重组蛋白免疫仔猪,制备抗血清,利用间接ELISA检测血清效价。将pVAX-pIL-10转染COS-7细胞,利用RT-PCR检测pmIL-10的转录,以间接免疫荧光(IFA)鉴定其与原核表达产物制备抗体之间的反应。结果显示:该试验成功获得了猪IL-10基因,重组菌pET-pmIL-10/Rosetta经IPTG诱导后,猪IL-10获得表达,目的蛋白表达量以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39.7%;以白油佐剂重组蛋白免疫仔猪可产生高水平的抗猪IL-10的抗体,经ELISA检测,P/N值可达到8,OD630吸光值可达1.875,该抗体与转染pVAX-pmIL-10的COS-7细胞发生明显的荧光反应,说明原核表达的重组猪IL-10免疫产生的抗体具有生物学活性,为日后利用猪IL-10抗体消除病毒感染中产生的内源性IL-10研究奠定了基础。     

猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。     

猪源Mx1基因的原核表达及其抗血清制备

利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8 mmol.L-1 IPTG诱导后4 h,猪源Mx1基因(poMx1)在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99×103。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带。结论:poMx1基因表达成功。     

猪流行性腹泻病毒N基因的克隆及原核表达

从患猪流行性腹泻的病猪粪便中分离了猪流行性腹泻病毒(PEDV)命名为HLJBY,将病毒在Vero细胞上传代,使之适应生长。将扩增的猪流行性腹泻病毒的N基因克隆到原核表达载体PET30a上,构建了重组表达质粒PET-30a-PEDV-N,并在37℃的条件下诱导表达,通过不同时间取样,经SDS-PAGE分析结果表明,该蛋白...