猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

实时荧光定量PCR技术在转基因猪生长激素基因差异表达中的应用

为确定猪生长激素基因(pGH)在F1代转基因猪体内的遗传稳定性及其在育肥初期表达水平的差异,利用SYBRGreenⅠReal-time PCR法检测精子介导纳米基因载体法获得的F0代母猪与非转基因公猪配种所产的7头转pGH基因猪和9头非转基因猪3月龄生长激素的表达水平。根据16个血液样品荧光定量结果绘制溶解曲线和扩增曲线图谱,并用F=(1+E)﹣ΔΔCt,公式进行Ct均值的分析,得出F1代转pGH基因猪生长激素平均表达水平是同期非转基因猪的1.77倍。结果证实,1)外源pGH基因在转基因猪体内能稳定传代;2)并非每头转基因猪体内pGH基因的表达量均高于非转基因猪;3)在F1代转基因猪体内,pGH的平均表达水平显著高于同期非转基因猪。本实验建立了能够稳定测评家猪生长激素相对基因表达水平的方法,为研究转基因与非转基因动物之间生理指标与定量表达的差异性等提供了科学依据。     

红褐色乌苏里貉MC1R基因的克隆及序列分析

为了探讨红褐色貉的促黑素细胞激素受体(MC1R)的序列长度、多态性以及与其他物种的同源性。以青岛莱西养殖基地的野生型乌苏里貉8只,红褐色乌苏里貉7只,吉林白貉6只,银黑狐6只为研究对象,用提取貉和银黑狐的毛囊DNA作为模板,根据GenBank已知序列(GenBank：HM852533.1)设计引物,利用克隆测序技术,通过SNP检测,分析MC1R基因在不同毛色乌苏里貉的表达水平和毛色之间相关性以及与其他物种的同源性。结果表明：本实验成功成功获得了红褐色貉MC1R基因序列长度为1329bp,与已知序列同源性98%,13处突变,与野生型乌苏里貉同源性达到99%,8处突变。通过酶切鉴定在MC1R基因约300bp处酶切得到2种基因型AB型和BB型,红褐色貉为AB型,野生型貉为BB型。根据实验结果推测MC1R基因存在红褐色毛色性状相关的功能突变位点,从而导致毛色突变。