烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶＵ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ＿基因及其邻近序列,将比ＣＤＮＡ片段克隆于ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒上,进行测序分析,结果表明ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸,与ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性的９９．０１和９８．８９％,与ＴＭＶ     

烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶ Ｕ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟 草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ）基因及其邻近序列。将此ｃＤＮＡ片段克隆于 ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质粒上,进行测序分析。结果表明：ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸。与 ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为９９．０１％和 ９８．８９％。与ＴＭＶ－Ｙｕ的ＭＰ基因序列比较,同源性分别为９８．１４％和９８．８９％。说明ＴＭＶ的ＭＰ基因 在不同株系中是非常保守的。     

猕猴桃钙调蛋白cDNA的克隆及测序

以“秦美”猕猴桃果实呼吸跃变初期ｃＤＮＡ第一链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序列合成５′端和３′端引物，利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）合成了完整的猕猴桃钙调蛋白ｃＤＮＡ，克隆并测定了其全序列。结果表明，猕猴桃钙调蛋白基因读码框架内序列由４４４个核苷酸组成，共编码１４８个氨基酸，且与植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列上与大麦有８６．１６％的同源性，与苜蓿有８５．６９％的同源性，其编码的氨基酸与大麦和苜蓿的不同分别只是一个氨基酸的差异，同源率高达９９．３％．     

稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的快速克隆(英文)

本文描述了一种简便而有效的克隆基因未知５＇和３＇末端序列的方法,并用此方法克隆了稻瘟病菌的３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）．即通过比较１２种真菌的已知ｇｐｄ基因序列,寻找内部的保守区段,设计并合成一对特异性引物．引物Ｐ１为靠近基因５＇端的一个特异性序列,引物Ｐ２则与３＇端的一段特异性序列互补．以双链ｃＤＮＡ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体连接物为模板,利用基因的特异性引物Ｐ１和载体上的标准测序引物Ｔ７,ＰＣＲ扩增出包含ｃＤＮＡ３＇末端的序列;利用特异性引物Ｐ２和标准测序引物Ｔ３,扩增出包含ｃＤＮＡ５＇末端的序列．将两片段分别克隆、测序和合并后,得到全长１０１１ｂｐ的稻瘟病菌３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）的编码区序列．该序列及其相应的氨基酸序列与已知真菌的ｇｐｄ基因序列有着６１．４％－８６．６％和６４．６％－８６．３％的同源性．特别在酶的活性功能区不同真菌间有着近乎相同的氨基酸序列．     

中国家蚕抗菌肽基因的PCR扩增,克隆和序列测定

本实验采用ＰＣＲ技术，扩增中国家蚕抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因片段，并以ＰＵＣ１９质粒为载体，将该基因片段转化到大肠杆菌中。从筛选得到的阳性克隆中分离出ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因，测定其序列，并由此推导出氨基酸序列。结果表明：（１）抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因片段长为８６６ｂｐ，包括７３ｂｐ的ＥｘｏｎＩ，５５６ｂｐ的Ｉｎｔｒｏｎ，８７ｂｐ的ＥｘｏｎⅡ和１５０ｂｐ的３’端非编码区。其中，非内含子部分的碱基序列与已克隆的日本家蚕的两个ｃｅｒｏｐｉｎＢｃＤＮＡ序列比较，同源性分别为８７．５％和９５％；（２）推导出的成熟抗菌肽由３７个氨基酸残基组成，其氨基酸序列与日本家蚕和天蚕的氨基酸序列相比较，同源性为９１．９％和８０．６％。     

EoSNPV egt基因的克隆和部分核苷酸序列的分析

以ＡｃＭＮＰＶ ｅｇｔ基因为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和原位杂交,克隆了含ＥｏＳＮＰＶ ｅｇｔ基因的４．９５ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ－Ｋ片段,并进一步亚克隆了含完整ｅｇｔ基因编码区的１．８ｋｂ ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＶ片段。应用双脱氧链终止法,测定了基因编码区中的Ｘｈｏ Ｉ－ＨｉｎｃⅡ片段４７１ｂｐ的核苷酸全序列,计算机分析表明,该片段编码的１５７个氨基酸序列与其它杆状病毒ｅｇｔ基因保守区的Ⅳ（部分）     

猕猴桃钙调蛋白cDNA的克隆及测序

以“秦美”猕猴桃果实呼吸跃变初期ｃＤＮＡ第一链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序更合成５端和３端引物，利用多聚酶锭式反应（ＰＣＲ）合成了完整的猕猴桃钙调蛋白ＣＤＮＡ，克隆并测定了其全序列。结果表明，猕猴桃钙调蛋白基因读码框架内序列由４４４个核苷酸组成，共编码１４８个氨基酸，且与植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列古与大麦有８６．１６％的同源性，与苜蓿有８５．６９％的同源     

一个与矮牵牛开花相关的MADS盒基因克隆与序列分析

利用逆转录－多聚酶链反应成功地从矮牵牛花瓣总ＲＮＡ中分离出一条长７４４ｂｐ的ｃＤＮＡ片段．该片段被克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中．序列分析表明，该ｃＤＮＡ片段与Ａｎｇｅｎｅｎｔ等发表的ｆｂｐ１基因仅在３′非编码区有２个核苷酸不同．它包含一个开放阅读框架，具有编码２４．６ＫＤ蛋白质能力．推导的蛋白质氨基酸序列中，Ｎ端包含一个完整的ＭＡＤＳ盒．该基因编码转录因子，参与花形态建成过程的调节机制     

一个与矮牵牛开花相关的MADS盒基因克隆与序列分析

利用逆转录－多聚酶莲反应成功地从矮牵牛花瓣总ＲＮＡ中分离出一条长７４４ｂｐ的ｃＤＮＡ片段。该片段被克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，序列分析表明，该ｃＤＮＡ片段与Ａｎｇｅｎｅｎｔ等发表的ｆｂｐｌ基因仅在３＇非编码区有２个核苷酸不同。它包含一个开放阅读框架，具有编码２４．６ＫＤ蛋白质能力。推导的蛋白质氨基酸序列中，Ｎ端包含一个完整的ＭＡＤＳ盒。该基因编码转录因子，参与花形态建成过程的调节机制。     

益生地衣芽孢杆菌天门冬氨酸激酶Ⅱ基因的PCR扩增及序列分析

通过聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增得到了益生地衣芽孢杆菌Ｈ８８ － ３ 株天门冬氨酸激酶（Ａｓｐａｒ ｔｏｋｉｎａｓｅ,ＡＫ） Ⅱ基因,并用ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ ３７７ ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ 进行序列测定,所得核苷酸序列及推导的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌ＶＢ２１７ 株进行了比较,结果它们的同源性非常高。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜(Brassica napus)基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域:两性N末端区(anamphipathicN-terminalre鄄gion),中心疏水区(acentralhydrophobicdomain),两性C-末端区(anamphipathicC-terminaldomain)。     

一株耐热菌的产酶研究及其羧酸酯酶基因的克隆

将一株近海温泉耐热菌ZH1的16S rDNA克隆至pUCm-T载体进行测序,测序结果在NCB I上进行BLAST分析,并构建了系统发育树,将该菌株归属为Geobacillus sp.ZH1.在65℃条件下的产酶定性实验结果表明,该菌株产脂肪酶、木聚糖酶和碱性磷酸酶.以菌株ZH1的基因组DNA为模板,使用羧酸酯酶简并引物进行PCR扩增,将目的基因克隆至pUCm-T载体后进行测序,得到了741 bp的DNA片段.BLAST分析显示,目的基因预测编码羧酸酯酶,包含246个氨基酸.     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。     

野生一粒小麦糖原合成酶激酶基因TbGSK1的克隆与分析

根据普通小麦糖原合成酶激酶基因序列设计引物,以野生一粒小麦cDNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出野生一粒小麦糖原合成酶激酶基因的cDNA序列,克隆到T载体上并进行测序。结果显示,该基因全长1543bp,开放阅读框1068bp,编码一个由355个氨基酸组成的蛋白。Southern blot分析显示,其在野生一粒小麦基因组中为单拷贝基因。该基因与普通小麦、玉米、烟草、苜蓿、拟南芥等植物的糖原合成酶激酶基因序列同源性分别达到94.1%、91.3%、83.2%、81.5%、72.8%。     

烟实夜蛾细胞色素P 450 cDNA片段的克隆与序列分析

昆虫细胞色素P 450与昆虫抗药性关系密切,本研究以烟实夜蛾5龄幼虫中肠的总RNA为模板,设计并合成简并引物,利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出了烟实夜蛾细胞色素P 450基因的cDNA片段,将其克隆到pMD 18-T载体进行序列测定,测序得到的491 bp的片断编码163个氨基酸残基,且该片断在阅读框内.与已公布的谷实夜蛾、棉铃虫和烟芽夜蛾细胞色素P 450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为98.7%,98.7%和92.1%.     

PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA

钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白, 可以促进钙激活酶活性的发挥, 从而促进肉的嫩化。采用PCR技术, 以山羊肝脏cDNA为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(calpainactivator) 基因, 并进行了序列测定。该片段长1 017bp, 5′—端非翻译区长39bp, 3′—端非翻译区长567bp。编码区长411bp, 编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质, 其理论分子量为14 298Da。与EdonMelloni等(1998) 报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现, 二者仅有五个位点不同。     

河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素-C基因的克隆与序列分析

探讨猪甘露聚糖结合凝集素-C基因的分子特征,从分子免疫学角度为猪的抗病育种研究提供理论依据.从长白猪肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR技术扩增pMBL-C基因,与pMD18-T载体连接,获得pMBL-C基因.序列测定结果显示该基因编码区为723bp,编码241个氨基酸残基.与已发表的猪MBL-C具有99%同源性;进化树分析显示与哺乳动物的MBL-C基因,尤其是牛的亲缘关系最近,而与MBL-A基因相差较大,与禽类的最远.该研究为进一步研究猪MBL分子的遗传特征提供了依据.