重组人乳铁蛋白对原代肝·肾细胞的毒性研究

[目的]通过模拟肝、肾毒性的体外细胞试验,研究重组人乳铁蛋白是否对小鼠原代肝肾细胞具有毒性作用,为其进一步的安全性评价提供依据。[方法]采用模拟体外消化试验所得的重组人乳铁蛋白消化产物及重组人乳铁蛋白为受试物,牛乳铁蛋白为对照,以小鼠原代肝、肾细胞为平台,用MTT法检测受试物对细胞活性的半数抑制浓度（IC50）,研究细胞毒性剂量一反应关系。[结果]在设定的试验条件下,未发现重组人乳铁蛋白对肝、肾细胞存在靶毒性,结果能与已进行的亚慢性毒性试验相互印证。[结论]为重组人乳铁蛋白的进一步安全性评价及其他转基因食品的安全性评价方法提供了参考。     

重组人乳铁蛋白对原代肝、肾细胞的毒性研究

[目的]通过模拟肝、肾毒性的体外细胞试验,研究重组人乳铁蛋白是否对小鼠原代肝肾细胞具有毒性作用,为其进一步的安全性评价提供依据。[方法]采用模拟体外消化试验所得的重组人乳铁蛋白消化产物及重组人乳铁蛋白为受试物,牛乳铁蛋白为对照,以小鼠原代肝、肾细胞为平台,用MTT法检测受试物对细胞活性的半数抑制浓度（IC50）,研究细胞毒性剂量-反应关系。[结果]在设定的试验条件下,未发现重组人乳铁蛋白对肝肾细胞存在靶毒性,结果能与已进行的亚慢性毒性试验相互印证。[结论]为对重组人乳铁蛋白的进一步安全性评价及其他转基因食品的安全性评价方法提供了参考。     

常乳中牛乳铁蛋白的纯化及抗菌活性研究

[目的]研究从常乳中纯化牛乳铁蛋白的工艺条件,探讨牛乳铁蛋白的抗菌活性。[方法]选用SP sepharose HP作为强阳离子交换介质,利用AKTApurifier10高效液相色谱仪纯化牛乳铁蛋白。[结果]结果表明,牛乳铁蛋白在pH值7.5、浓度0.85 mol/L的NaCl洗脱液中可以被洗脱下来,且产品纯度为90%以上。牛乳铁蛋白浓度为5 mg/ml时对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。[结论]该研究建立了从常乳中纯化牛乳铁蛋白的方法,为大规模生产具有活性的牛乳铁蛋白奠定了基础。     

转人溶菌酶牛乳营养成分及食用安全研究

[目的]探究转人溶菌酶牛乳和非转基因牛乳的营养成分差异,以及重组人溶菌酶的食用安全性.[方法]通过测定转基因和非转基因组2种乳样乳常规、氨基酸和脂肪酸的含量,比较其成分差异.通过大鼠、小鼠急性经口毒性试验以及模拟胃肠液消化稳定性试验检测重组人溶菌酶的食用安全性.[结果]营养成分检测结果表明,转人溶菌酶牛乳和非转基因牛乳相比,细菌总数偏高,脂肪含量偏低,其他营养成分无明显的变化;食品安全评估说明重组人溶菌酶属于实际无毒蛋白,且无潜在的致敏性.[结论]该试验验证了转人溶菌酶牛乳的食用安全性.     

反相高效液相色谱法同时检测多种乳清蛋白成分

建立一种快速、简便鉴定和定量检测乳清蛋白中牛乳铁蛋白(bLf)、转基因人乳铁蛋白(rLf)、α-乳白蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)的方法。对样品进行离心脱脂和酸法去除酪蛋白,水洗乳脂和酪蛋白以提高α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白(Lf)的回收率。乳清通过高效液相色谱检测,采用Proteonavi反相C4色谱柱,以体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.5mL/min,柱温35℃,检测波长280nm。结果显示:此方法可以有效分离牛α-乳白蛋白、牛β-乳球蛋白、牛乳铁蛋白和转基因人乳铁蛋白。标准品线性关系良好,平均回收率在正常范围内。     

猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测

为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。     

人乳铁蛋白的沙漠小球藻表达系统的构建与鉴定

为获得人乳铁蛋白的沙漠小球藻(Chlorella sp.GTD8A1)的表达系统和稳定的小球藻GTD8A1-h LF工程藻种,将人乳铁蛋白基因导入小球藻细胞中进行表达鉴定。以人血c DNA为模板,RT-PCR扩增得到人乳铁蛋白基因(Gen Bank登录号NM-002343.4),经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,连接到植物表达载体p CAMBIA2300-35S-OCS中,获得重组质粒载体p CAMBIA2300-35S-h LF-OCS,将重组质粒电击转入GTD8A1中,通过菌落PCR鉴定后扩大培养,在DNA和RNA水平分析人乳铁蛋白基因的整合和转录,SDS-PAGE和Western Blot分析获得70 ku的目的蛋白;将转基因藻种(GTD8A1-h LF)在BBM培养基中进行培养周期优化。结果表明,重组人乳铁蛋白在沙漠小球藻细胞中表达成功;通过Elisa测其人乳铁蛋白表达量在20 d时达到最大,浓度为13.28 mg/L。     

牛乳素Lfcin B基因的合成及其在酵母菌中的表达研究

[目的]为临床研究和治疗某些病原微生物引起的感染提供依据。[方法]参照LfcinB的氨基酸序列,利用化学合成法合成LfcinB基因并克隆到pPIC9K载体中,转化到酵母菌GS115感受态细胞中,用抗性选择标记G418筛选出高拷贝酵母菌转化子。利用甲醇诱导表达重组LfcinB,经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白牛乳铁蛋白素的表达情况,同时通过体外抑菌试验检测表达产物的抑菌活性。[结果]提取的酵母菌DNA扩增出1条预期的560bp左右的特异性条带。目的基因已经成功克隆到pPIC9K载体中,并转到酵母菌GS115中而且获得了表达。重组酵母表达上清中牛乳铁蛋白素抗菌肽对沙门氏肠炎杆菌的抗菌活性为42.857IU/ml,表明LfcinB基因的酵母表达载体构建成功。[结论]该研究证明利用化学合成法直接合成编码LfcinB的DNA构建真核表达载体、通过生物发酵工程来制备LfcinB是可行的。     

牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(h/b)的克隆、表达及溶血活性分析

[目的]实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性.[方法]PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应.[结果]测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103Hu·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应.[结论]成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础.此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法.     

重组人gdnf在人乳腺肿瘤上皮细胞中表达的研究

为了在人乳腺肿瘤上皮细胞系中表达重组人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体,用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞中,经G418抗性筛选8~10 d后,分离稳定表达红色荧光蛋白的转染细胞,PCR鉴定转基因细胞,用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,RT-PCR和Western Blot检测重组人GDNF的表达分泌。结果表明:重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体被成功构建,转染Bcap-37细胞后,稳定整合到细胞染色体中,转基因细胞经激素诱导后能够表达分泌糖基化的GDNF,为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。     

一种新的耐热性植酸酶基因在烟草中的表达

[目的]探究一种新的耐热性植酸酶基因在烟草中的表达结果。[方法]克隆了泡盛曲霉植酸酶基因编码区全序列,使其在烟草中高效表达,对重组植酸酶与天然植酸酶性质进行初步的分析和比较。[结果]对烟草叶片的植酸酶活性检测结果表明,重组植酸酶基因在烟草中得到较高水平表达,转基因植株的最高植酸酶活力为对照烟草的13倍;对烟草重组植酸酶蛋白的酶学性质进行了初步分析,结果表明重组植酸酶拥有与天然植酸酶同样的最适pH值和最适温度,耐热性略微下降,但在80℃处理15 min后仍有33%的残余酶活力。[结论]该研究为该植酸酶基因转化饲料作物的开发提供理论依据,也为泡盛曲霉植酸酶的工业化生产开辟了新的途径。     

人白介素-12转基因马铃薯中hIL-12的表达

[目的]研究人白介素-12转基因马铃薯中hIL-12的表达。[方法]采用ELISA和WesternBlot,检测转基因马铃薯中hIL-12的表达情况。[结果]转基因马铃薯叶与块茎中均能被hIL-12p70二聚体特异性的抗体识别的蛋白表达,与野生对照组相比均有0.01水平显著差异。WesternBlot分析结果显示,在40kD处有特异性的蛋白条带出现。[结论]所建立的人白介素-12转基因马铃薯表达体系能正确、有效表达hIL-12二聚体。     

江苏某奶牛场荷斯坦牛泌乳初期乳成分分析

[目的]为泌乳奶牛牛群的管理、营养调控、保证生鲜乳质量等方面提供理论依据.[方法]对江苏某奶牛场荷斯坦泌乳初期奶牛产奶量及乳成分含量进行测定,分析中国荷斯坦奶牛群在不同泌乳月、胎次和产奶量等条件下乳成分及各成分间相关性.[结果]该牛场中国荷斯坦牛在乳泌初期泌乳月份对乳中常规乳成分及酸度具有显著影响.产奶量对泌乳初期乳成分含量有明显影响.泌乳早期乳中常规营养成分及滴定酸度间存在一定的相关性,乳脂肪与密度呈显著负相关,非脂乳固体与密度、冰点以及乳蛋白存在显著正相关.[结论]该研究为奶牛生产实践提供一定参考依据.     

荷斯坦奶牛产奶量遗传力的估计

[目的]探究新疆呼图壁种牛场荷斯坦奶牛主要经济性状的遗传力.[方法]收集呼图壁种牛场1996～2010年15年间荷斯坦牛泌乳期的生产性能记录,其中包括9 901条奶产量记录.采用SAS(8.1)最小二乘分析过程分析场、年度、季节、胎次四个非遗传因素对新疆呼图壁种牛场荷斯坦牛产奶量的影响.[结果]场、年度、季节、胎次四个非遗传因素对产奶量均有极显著影响(P＜0.01).[结论]根据各因素的显著情况进行了固定效应划分,利用MTDFREML软件对荷斯坦牛进行遗传参数估计,估计了产奶量的方差组分和遗传力,产奶量的遗传力为0.4.     

山羊转人乳铁蛋白基因成纤维细胞和乳腺上皮细胞单克隆的制备及扩大培养

[目的]为探索单个转基因阳性细胞快速扩大培养成为细胞克隆的技术体系。[方法]对转染人乳铁蛋白(Human lactoferrin,hLF)基因乳腺特异性表达载体pBLM-C1的单个山羊胎儿成纤维细胞(Fetal Fibroblasts,FF)和乳腺上皮细胞(Mammary Gland Epithelial,MGE)细胞进行克隆。在96孔板中,首先用3种浓度(V/V:0、50%和100%)的适应性条件培养基对单个转染细胞进行细胞单克隆的制备,进而把转染细胞单克隆与非转染细胞共培养进行扩大培养,neo基因被用于筛选基因,以PCR方法鉴定转染细胞基因组DNA。并对单克隆细胞进行染色体核型分析。[结果]与非适应性条件培养基相比,100%适应性条件培养基能够显著提高细胞单克隆存活率;与对照相比,转染细胞单克隆与非转染细胞共培养,显著提高了转染细胞单克隆扩大培养后的比率(FF:53.33%vs.10.00%;MGE:33.33%vs.6.670%),且明显缩短了扩大培养汇合时间(20～30 d);PCR鉴定结果表明,上述方法获得的克隆细胞整合有hLF目的基因;核型分析表明,大部分细胞克隆染色体正常。[结论]该研究可为分离转基因细胞、理想载体的插入及诊断提供一种可靠的方法,并能节省转基因动物生产的及费用时间。     

荷斯坦牛头胎产奶量的遗传分析

【目的】通过估计呼图壁种牛场荷斯坦头胎305 d产奶量的遗传参数和育种值,为该场选留核心母牛群,建立遗传评估体系以及评价种公牛的优劣。为合理的组织奶牛生产和提高选种准确率及改良效率提供可靠的科学依据供参考。【方法】对新疆呼图壁种牛场1426头荷斯坦奶牛头胎305 d产奶量及系谱资料,运用SAS软件进行统计分析,观察场、产犊年份、产犊月份、初产月龄等4种因素对产奶量的影响,研究305 d产奶量的季节性变化规律,并用BLUPf90程序估计305 d产奶量的遗传力及育种值。【结果】牧场;产犊年份;产犊月份对305 d产奶量均影响极显著（P＜0.01）,初产月龄对305 d产奶量影响不显著（P＞0.05）;产奶量随季节的变化而发生明显的变化,冬、春季产奶量相对于其他季节要高;产奶量的遗传力为0.268,获得个体及各祖先产奶量的估计育种值,其范围为1967.04～－1042.78,其差值为3009.82 kg。【结论】在这个奶牛群体里,遗传差距较大,个体遗传能力较好,为合理的组织奶牛生产和提高选种准确率及改良效率提供可靠的科学依据供参考。     

Expression of recombinant human butyrylcholinesterase in the milk of transgenic mice

Butyrylcholinesterase (BCHE) is a natural bioscavenger that protects humans against organophosphate toxicity. Due to the limited yield of human BCHE (hBCHE) when purifying from human plasma, it is necessary to find an alternative method to produce this protein. One potential method is to produce transgenic livestock that make modified milk containing high concentration of hBCHE. In this study, we cloned the hBCHEgene into a human lactoferrin (hLF) bacterial artificial chromosome (BAC) construct to make a hLF-hBCHE BAC construct. Subsequently, we injected the BAC construct into pronuclei of mouse fertilized embryos and generated transgenic mice. Expression analysis showed that recombinant hBCHE (rhBCHE) was expressed efficiently in the mammary gland of the transgenic mice and the concentration of rhBCHE in the milk of individual mice ranged from 76±12 to 159±28 mg·L^-1. Protein function tests showed that rhBCHE has the same enzymatic activity as the native hBCHE. Our results pave the way for making transgenic livestock to produce large quantities of rhBCHE.     

奶牛布鲁氏杆菌的分离与鉴定

[目的]为布鲁氏杆菌的分离与鉴定提供依据。[方法]时某奶牛场进行布病调查,采集血清、血液、牛奶等样品通过硫化氢产,生试验、染料抑菌试验和热凝集试验进行布鲁氏抒菌的分离与鏊定。[结果]21份牛奶样品在浓度10％CO2培养葙中培养至第4天时,有5份培养基上生长出30～50个0．05～2．00mm大小无色、闪光圆形、湿润、隆起的可疑小菌落。硫化氢产生试验结果表明,5个菌株均可产生硫化氢;染料抑菌试验结果表明,5个菌株确为布鲁氏杆菌;热凝集试验结果表明,该5菌株未发生变异;PCR检测结果表明,相对应的牛奶检测呈阳性。[结论]初步鉴定从布病可疑阳性牛分离出的5个菌株为牛布鲁氏杆菌。     

转人乳铁蛋白羊奶生物安全试验

为了解转人乳铁蛋白羊奶与普通羊奶之间的差异,将两种羊奶的主要成分及其物理性状进行了比较;同时,参考中华人民共和国农业行业标准《转基因植物及其产品食用安全检测——大鼠90天喂养实验》(NY/T 1102-2006)进行转基因羊奶食用安全评价。实验结果表明,90天灌喂转人乳铁蛋白羊奶的大鼠与普通羊奶灌喂组血常规值差异不显著(P>0.05);灌喂转人乳铁蛋白的羊奶中、高剂量组与自由采食对照组及普通羊奶中、高剂量灌喂组大鼠血清铁含量及铁蛋白含量差异显著(P<0.05)。转人乳铁蛋白羊奶与普通羊奶具有实质等同性,转基因成分没有干扰机体对其它营养物质的吸收,从营养学角度来评价,转人乳铁蛋白羊奶是安全的。