转基因马铃薯中人白介素-12体外诱导人肝癌细胞凋亡的研究

[目的]检测从人白介素-12（human interleukin12,hIL-12）转基因马铃薯中提取的hIL-12的抗肝癌效应。[方法]用MTT法检测转基因马铃薯中hIL-12对人肝癌细胞HepG22.2.15的体外杀伤作用;用AnnexinV/PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察转基因马铃薯中hIL-12对HepG22.2.15细胞的诱导凋亡作用。[结果]转基因马铃薯中表达的hIL-12与重组人白介素-12（rhIL-12）在体外对HepG22.2.15具有杀伤作用,而野生对照组无杀伤作用;AnnexinV/PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察结果表明,转基因马铃薯中表达hIL-12可诱导HepG22.2.15细胞凋亡。[结论]转基因马铃薯表达体系表达的人白介素-12具有抗肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用。     

转基因马铃薯中人白介素-12体外诱导人肝癌细胞凋亡的研究（摘要）

[目的]检测从人白介素-12（human interleukin 12,hIL-12）转基因马铃薯中提取的hIL-12的抗肝癌效应。[方法]用MTT法检测转基因马铃薯中hIL-12对人肝癌细胞HepG22.2.15的体外杀伤作用;用AnnexinV/PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察转基因马铃薯中hIL-12对HepG22.2.15细胞的诱导凋亡作用。[结果]转基因马铃薯中表达的hIL-12与重组人白介素-12（rhIL-12）在体外对HepG22.2.15具有杀伤作用,而野生对照组无杀伤作用;An-nexinV/PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察结果表明,转基因马铃薯中表达hIL-12可诱导HepG22.2.15细胞凋亡。[结论]转基因马铃薯表达体系表达的人白介素-12具有抗肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用。     

人白细胞介素-12的纯化及鉴定

[目的]利用人白细胞介素-12(human interleukin 12,hIL-12)转基因马铃薯,探讨hIL-12的纯化条件。[方法]提取转基因马铃薯中的总蛋白,hIL-12的分离纯化步骤包括超滤、MKF-AIW阴离子交换层析、MKF-CIC阳离子交换层析。在阴离子交换层析吸附过程中采用试管法选择最佳吸附pH值,选择洗脱过程最佳洗脱pH值;选择阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值;ELISA法测定各纯化阶段收集的上清液或洗脱峰中的hIL-12的含量;非还原SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;Western Blot检测纯化的hIL-12。[结果]阴离子交换层析吸附过程最佳吸附pH值为7.5,洗脱过程最佳洗脱pH值为7,阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值为6.5。纯化的hIL-12经非还原SDS-PAGE分析蛋白纯度为91%。Western Blot分析结果表明,在40 kD处有特异的蛋白条带出现。[结论]hIL-12转基因马铃薯经总蛋白提取,超滤,阴离子交换层析,阳离子交换层析纯化,获得了高纯度的hIL-12。     

人白细胞介素-12的纯化及鉴定

[目的]利用人白细胞介素-12(human interleukin 12,hIL-12)转基因马铃薯,探讨hIL-12的纯化条件.[方法]提取转基因马铃薯中的总蛋白,hIL-12的分离纯化步骤包括超滤、MKF-AIW阴离子交换层析、MKF-CIC阳离子交换层析.在阴离子交换层析吸附过程中采用试管法选择最佳吸附pH值,选择洗脱过程最佳洗脱pH值;选择阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值;ELISA法测定各纯化阶段收集的上清液或洗脱峰中的hIL-12的含量;非还原SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;Western Blot检测纯化的hIL-12.[结果]阴离子交换层析吸附过程最佳吸附pH值为7.5,洗脱过程最佳洗脱pH值为7,阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值为6.5.纯化的hIL-12经非还原SDS-PAGE分析蛋白纯度为91%.Western Blot分析结果表明,在40 kD处有特异的蛋白条带出现.[结论]hIL-12转基因马铃薯经总蛋白提取,超滤,阴离子交换层析,阳离子交换层析纯化,获得了高纯度的hIL-12.     

从转基因马铃薯中纯化的人白细胞介素-12的生物学活性分析

[目的]研究从转人白细胞介素-12（hIL-12）基因马铃薯中纯化的hIL-12的生物学活性。[方法]MTT法检测纯化的hIL-12体外抗肿瘤作用。[结果]纯化的hIL-12在体外对NK敏感肿瘤细胞K562有杀伤作用,而野生对照组无作用。[结论]试验中从转hIL-12基因马铃薯中纯化的hIL-12具有生物学活性。     

转基因马铃薯中纯化人白介素-12的生物学活性分析

分析了转基因马铃薯中纯化人白介素-12（hIL-12）的生物学活性。结果表明,hIL-12纯化品在体外能刺激植物凝集素（PHA）活化的外周血单个核细胞（PBMC）增殖;hIL-12纯化品对人肝癌细胞HepG2．2．15的生长具有抑制作用,且其抑制效果随hIL-12浓度的升高而增强;hIL-12纯化品在体外对乙肝病毒DNA的复制和表面抗原、e抗原的分泌产生抑制作用.     

FKBP12．6对异丙肾上腺素所致心脏肥大和纤维化的影响

[目的]利用FKBP结合蛋白12．6心脏特异性转基因（TG）小鼠,探讨FKBP12．6过表达在ISO所致心脏肥大纤维化病理过程中可能的保护作用。[方法]TG和对照非转基因（NTG）小鼠,连续皮下注射小剂量异丙肾上腺素（ISO）,诱导扩张性心肌肥大和纤维化,通过心脏超声、PV－Loop等生理学和病理组织学等手段检测心脏功能和组织结构的变化。[结果]ISO未处理的TG和NTG小鼠相比较,心脏超声和PV-Loop指标以及纤维化和心肌细胞横截面积等无统计学差异;ISO处理后动物心脏呈扩张性肥大和纤维化表现,但TG和NTG小鼠之间功能学及病理组织学指标无统计学差异。[结论]未观察到心脏特异性过表达FKBP12．6对ISO诱导心肌损伤有明显的保护作用,FKBP12．6可能并不直接影响心肌细胞内质网RyR2的功能。     

菊花CmGATA12基因促进开花的分子机制

[目的]本文旨在探究菊花CmGATA12基因的功能,分析其表达特征,并转入拟南芥中对其功能进行初步研究。[方法]从菊花品种‘清露’中克隆获得CmGATA12全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,同时利用实时荧光定量PCR分析CmGATA12在菊花不同组织中的表达变化;将CmGATA12基因转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,并分析CmGATA12转基因拟南芥中相关开花基因的表达变化。[结果]CmGATA12与拟南芥GATA家族的AtGATA13和AtGATA8的遗传距离最近。组织定量分析表明CmGATA12在菊花的茎中表达量最高,在芽中表达量最低。亚细胞定位和转录活性试验表明,CmGATA12定位在细胞核和细胞膜并且具有转录激活活性。统计CmGATA12转基因拟南芥植株的开花时间和莲座叶片数发现,CmGATA12转基因拟南芥植株的开花时间均提前于野生型拟南芥植株,开花时的莲座叶片数均低于野生型拟南芥植株。CmGATA12转基因拟南芥植株相关开花基因的表达中,促进开花的基因AtSPL5和AtGI在CmGATA12转基因植株中较野生型拟南芥中的表达量上调,抑制开花的基因AtSVP、AtFRI、AtTOE1和AtTOE2在CmGATA12转基因植株中较野生型表达量下调。[结论]本研究克隆得到的菊花CmGATA12基因,具有促进拟南芥开花的功能。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

葡萄MrRPV1蛋白LRR结构域的功能研究

[目的]明确葡萄霜霉病抗性蛋白(MrRPV1)LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响,为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础.[方法]将MrRPV1和白粉病抗性蛋白(MrRUN1)两个蛋白的LRR结构域互换,构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株,并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定.[结果]共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因(重组了MrRPV1蛋白LRR结构域)株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因(重组了MrRUN蛋白LRR结构域)株系.在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中,仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点,肉眼观察不到白色霜霉状物,但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性.在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中,RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性,有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死(PCD);RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病.[结论]MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别,而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别.     

人α干扰素转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人α干扰素（interferon-α,IFN-α）转基因小鼠,为研究IFN-α在抗病毒中的作用提供模型动物。[方法]将人IFN-α基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过原核显微注射法建立IFN-α转基因小鼠。[结果]通过特异性引物PCR法和South-ern杂交法检测出4只阳性转基因小鼠。分离4个转基因鼠系F1代PCR阳性小鼠血液中的淋巴细胞进行RT-PCR检测,其中3个鼠系为阳性。收集阳性小鼠血清,用ELISA方法和微量板染色测定法检测出3个转基因鼠系均有IFN-α表达。[结论]成功建立了CMV启动子启动的表达人IFN-α基因转基因小鼠,为研究干扰素抗病毒机制及对其他动物进行抗病毒感染基因工程育种研究奠定了基础。     

利用转基因牛生产重组人乳铁蛋白研究

[目的]研究利用转基因牛生产重组人乳铁蛋白,为利用转基因动物生产药用或食用蛋白提供依据。[方法]对已获得的人乳铁蛋白转基因牛进行人工催乳,用乳成分分析仪分析了转基因对乳汁的影响,并利用放免法检测了重组人乳铁蛋白在转基因牛乳中的表达。[结果]重组人乳铁蛋白在牛乳中获得了高效表达,表达水平为(3.429±0.417)mg/ml。通过转基因牛乳的乳成分分析发现,转基因牛乳与常乳在乳脂、总蛋白、乳糖和干物质的含量上没有明显变化。[结论]重组人乳铁蛋白在转基因牛乳中获得了高效表达,为大规模生产重组人乳铁蛋白奠定了基础。     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.     

鲜切马铃薯实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择鲜切马铃薯实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中合适的内参基因。[方法]以受到高温、光照等胁迫的鲜切马铃薯为材料,应用qRT-PCR技术,分析18S rRNA、GAPDH、Actin和EF1a 4个常用内参基因的表达情况。[结果]经GeNorm软件分析发现,当利用qRT-PCR分析比较鲜切马铃薯中的基因表达差异时,可选择Actin作为校正内参基因。[结论]该研究为进一步开展鲜切马铃薯分子生物学研究奠定了方法学基础。     

转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用

[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3’端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3’端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出“拷贝数依赖性”。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。