鸡球虫共同抗原UCE免疫原性分析及其对多种球虫感染的免疫保护效果评估

[目的]在前期研究中,筛选到了存在于多种鸡球虫间的共同抗原泛素缀合酶结构域蛋白(UCE),本研究进一步分析其免疫原性,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[方法]提取纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增堆型艾美耳球虫UCE基因(EaUCE),插入pVAX1质粒,构建真核表达质粒pVAX-EaUCE,通过RT-PCR和Western blot检测pVAX-EaUCE在鸡体内的转录和表达情况。经流式细胞术和间接ELISA法检测pVAX-EaUCE免疫后鸡体细胞免疫和体液免疫水平变化,分析其免疫原性。分别采用柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫及三者的混合卵囊人工感染雏鸡,观察感染前、后雏鸡体质量变化和排出卵囊减少量,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[结果]EaUCE基因开放阅读框为444 bp,编码148个氨基酸,BLAST分析显示,柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫UCE氨基酸序列同源性均大于95%。pVAX-EaUCE能够在鸡体内成功转录和表达。pVAX-EaUCE免疫后,鸡体的CD_4~+/CD_3~+和CD_8~+/CD_3~+细胞比例显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D、TGF-β4 mRNA和IgY抗体水平显著升高,表明免疫该质粒能诱导细胞和体液产生免疫反应(P0.05)。pVAX-EaUCE免疫后,与对照组相比,免疫组鸡体质量显著增加,卵囊产量明显下降,肠道损伤也相应减轻。[结论]鸡球虫共同抗原UCE具有良好的免疫原性,可对多种球虫感染提供部分免疫保护力,有望成为抵抗多种球虫感染的候选抗原。     

柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗的构建及其在鸡肌肉组织中的表达

利用DNA重组技术,分别将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)pEtK2基因单独或与鸡白细胞介素2基因(IL-2)串联克隆到DNA疫苗载体pVAX1或pcDNA4.0(c)上,构建了pVAX1-pEtK2、pcDNA4.0(c)-pEtK2、 pVAX1-pEtK2-IL-2、pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2 DNA疫苗.酶切鉴定正确后分别将重组质粒胸肌注射14日龄雏鸡,1周后取注射部位肌肉组织,用RT-PCR和Western-blotting 法检测保护性抗原的表达情况.结果表明,抗原基因pEtK2和pEtK2-IL-2串联基因均能在注射部位肌肉组织中成功表达.     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株SO7基因的克隆表达与保护性试验

【目的】克隆鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因并进行原核表达,检测表达产物的免疫原性,为鸡球虫基因疫苗的制备奠定基础。【方法】以纯化的柔嫩艾美耳球虫杨凌(Eimeria tenella YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的SO7基因,对其测序后进行序列分析。将SO7基因克隆到表达载体pET-32a中,构建pET-SO7重组质粒,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,评价其免疫效果。【结果】鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因序列的开放阅读框(ORF)为651个碱基,共编码217个氨基酸。E.tenella YL株SO7基因与E.tenella LS18株、E.tenella BJ株、E.tenella GD株SO7基因ORF区序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%,其氨基酸序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%。SDS-PAGE分析表明,表达产物成功地表达出了分子质量为45ku的融合蛋白。各种抗球虫指标的测定结果显示,该蛋白对球虫感染鸡体具有一定的保护性。【结论】SO7基因具有很强的保守性,各虫株之间差异不大;重组蛋白具有一定的保护效果,适合用来制备基因疫苗。     

硒缺乏雏鸡十二指肠黏膜IL-4和IL-6及GPXs变化的研究

探讨硒(Se)缺乏雏鸡十二指肠黏膜中细胞因子IL-4和IL-6水平的变化及其与抗氧化关系。选择SPF雏鸡为试验动物,采用富硒酵母(SEY)饮食调节控制雏鸡血液及十二指肠黏膜中Se含量。一组为Se缺乏组(SeD),饲喂饲料中Se含量0.01 mg·kg-1;另一组对照组,饲喂正常Se水平饲料(补充SEY,Se含量为0.40 mg·kg-1)。ELISA检测雏鸡十二指肠黏膜中GPXs(GPX1、GPX2和GPX4)及细胞因子IL-4和IL-6的表达量。结果表明,在试验第7、14 d和21 d,与对照组相比,SeD组血液及十二指肠黏膜组织中硒含量第7、14 d和21 d均减低(P0.05或P0.01);与相应的对照组比,SeD组中GPXs(GPX1、GPX2和GPX4)的表达量显著减少(P0.05);SeD组的雏鸡十二指肠粘膜细胞因子IL-4和IL-6表达量升高(P0.05或P0.01)。证明了SeD导致雏鸡十二指肠黏膜中抗氧化能力降低,细胞因子IL-4和IL-6的表达量升高。     

假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡盲肠结构的影响

为假蒟植物资源的开发利用提供参考,以假蒟提取物的干燥粉和270只1日龄海南文昌雏鸡为试验材料,采用分栏饲喂方法研究假蒟提取物干燥粉对感染柔嫩艾美耳球虫鸡盲肠结构的影响。结果表明:在海南文昌雏鸡日粮中添加100mg/kg、200mg/kg和300mg/kg假蒟提取物干燥粉可缓解柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠粘膜的损伤,减轻盲肠病变程度。在雏鸡基础日粮中添加假蒟提取物具有一定抗球虫作用。     

E.necatrix二次感染雏鸡消化道局部体液Igs含量变化

采用间接酶联免疫吸附试验法检测了毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)二次感染雏鸡肠液和胆汁IgA、IgM、IgG含量变化。结果表明,在E.necatrix二次大剂量攻击性感染雏鸡后的初期,三种免疫球蛋白含量呈现一过性下降,随即回升,14d较对照和初次感染雏鸡明显增加,表明球虫初次感染所激发的高水平体液免疫对其二次感染有良好的免疫保护作用。     

柔嫩艾美尔球虫的分离及病理学观察

采用单卵囊感染技术,从鸡球虫混合种中分离出1株柔嫩艾美尔球虫(E im eria tenella)。并对该株柔嫩艾美尔球虫的病理学做了进一步研究。利用柔嫩艾美尔球虫的寄生部位、肉眼病变、临床症状等生物学特性进行鉴定,并做回归动物实验,用此球虫卵囊100,000个感染雏鸡。取8天后明显病理变化的盲肠组织,采用石蜡切片技术,进行病理学观察。结果表明,在盲肠肠绒毛上皮、肠腺及肌层都有虫体寄生,并且有明显的出血病变。     

鸡饲料中添加红景天预防柔嫩艾美尔球虫的效果

[目的]为了探明红景天对柔嫩艾美尔球虫预防效果,对于发展养鸡业提供一定的指导意义.[方法]选12日龄100只商品代雏鸡随机分为5组,阴性对照组、阳性对照组、1.5％红景天组、1.0％红景天组及0.5％红景天组.14日龄时,除阴性对照组不攻虫外,其余4组分别口服接种4000个柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊.21日龄剖杀,同时测定所有鸡只的增重、存活率、盲肠病变分值、卵囊产量以及抗球虫指数(ACI).取各试验组鸡只的盲肠进行病理组织学观察,采集血清并测定相关的细胞因子.[结果]饲喂红景天的鸡在增重、存活率、盲肠病变分值、卵囊排出量以及ACI等指标上均优于阳性对照组,且低剂量组效果最好;在饲料中添加红景天可以显著降低感染鸡球虫后雏鸡血清中的白介素2 (IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和提高血清IgG的含量.[结论]红景天对感染柔嫩艾美尔球虫的雏鸡有一定的预防作用.     

重组基因工程乳酸菌的研究进展

乳酸菌作为人和动物体内的正常菌群,具有诸多益生功能.随着分子生物学研究的不断深入,重组基因工程乳酸菌研究取得了较快进展.在构建表达外源功能性基因的重组基因工程乳酸菌、表达保护性抗原蛋白质用以递呈黏膜免疫抗原的过程中,乳酸菌质粒载体起到了至关重要的作用.电转化技术的应用,简化了操作过程,推动了重组基因工程乳酸菌的研究与应用.     

干酪乳杆菌对雏鸡空肠黏膜结构及炎性因子水平的影响

为研究干酪乳杆菌对沙门菌感染雏鸡空肠黏膜上皮损伤的保护作用,以450只1日龄SPF健康雏鸡为研究对象,随机分成正常对照组、沙门菌组、干酪乳杆菌组、预防组、治疗组和预防治疗组,每组5个重复,每个重复15只鸡。分别用HE染色和酶联免疫吸附(ELISA)法检测雏鸡肠道黏膜结构变化和肠道中炎性因子表达量的变化情况。结果显示:1)与沙门菌组相比,饲喂干酪乳杆菌预防使肠绒毛上皮柱状细胞排列整齐,维持肠绒毛的完整性。2)饲喂干酪乳杆菌使得沙门菌感染组的促炎因子IL-17、IFN-γ和TNF-α的表达量显著减少(P<0.05),而抗炎因子IL-10的表达量显著增多(P<0.05)。综上,饲喂干酪乳杆菌能保护雏鸡肠道健康,减轻沙门菌对雏鸡空肠黏膜的损害,加强肠道的免疫功能。本研究为干酪乳杆菌预防畜禽沙门菌感染并应用于生产实践提供理论依据。     

鸡球虫病疫苗研发新思考

虽然球虫激发宿主产生的保护性免疫应答机制已有很多相关研究,但是保护记忆性免疫应答机制这一关键点常常被忽视。高效保护记忆性免疫应答是球虫感染宿主和球虫病疫苗设计的基础。本研究对该领域50年的相关研究进行系统性回顾和分析,提出开发高效球虫疫苗的设想和评估候选球虫病疫苗产生高效免疫保护的新策略,该设想和新策略基于产生高效保护性记忆免疫应答的三大关键点,即产生免疫水平的阈值、效应部位以及时间。结果表明:1)球虫病活卵囊疫苗与球虫重组蛋白疫苗、DNA疫苗、以病毒或细菌为载体的球虫病活载体疫苗免疫鸡群激发宿主产生的免疫应答存在本质区别,活卵囊疫苗免疫过的鸡对球虫的感染处于“Primed”免疫状态(即免疫系统可快速高效地识别球虫百余个抗原,抵抗球虫再次感染的能力更高。),而非活卵囊疫苗对球虫的感染仍处于“Naive”状态(即免疫系统仅能识别特定的1个或几个球虫抗原,抵抗球虫再次感染的能力较弱。)。这也是目前研发的基于一个或几个抗原的球虫“死”疫苗效果不佳的根本原因。2)高效的保护性记忆免疫应答的主要机制是多种效应机制协同发挥作用,如肠道微环境中的组织常驻记忆细胞(Tissue resident memory cells,T_RM)、循环的效应记忆细胞(Effector memory T cells,T_EM)、中心记忆性T细胞(Central memory T cell,T_CM),尤其是T_RM的量和质起关键作用。在疫苗设计中可以将抗原靶向可激发宿主产生针对鸡球虫高效保护性记忆免疫应答的重要部位—肠道。3)抑制球虫早期裂殖生殖是记忆性免疫应答抵抗球虫感染最重要的特征,为评估高效球虫疫苗提供了新思路。综上,对鸡球虫感染过程中产生高效免疫保护的机制有清晰的认识和理解,是实现基于免疫学理论的球虫病科学防控的基础。     

人参皂苷抗鸡新城疫病毒的试验研究

为探讨人参皂苷抗鸡新城疫病毒的作用机理,试验用鸡新城疫病毒人工感染雏鸡,采取人参皂苷口服,观察试验鸡只的临床症状及体重变化,测定血清抗体效价的变化情况。结果表明,人参皂苷组可以明显推迟人工感染鸡新城疫病毒(NDV)雏鸡的发病日龄,缩短病鸡的发病过程。试验鸡饲喂人参皂苷后可明显降低发病率和死亡率并促进抗体的产生。说明人参皂苷可以降低病毒对组织的损害程度,增强雏鸡对新城疫病毒的抵抗力。     

鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IFN-γ的构建

利用DNA重组技术,分别构建pVAX1-pEtK2、pcDNA4.0(c)-pEtK2、pVAX1-pEtK2-IFN-γ、pcDNA4.0(c) -pEtK2- IFN-γ DNA疫苗载体.重组质粒肌肉注射14日龄鸡,1周后肌肉注射部位组织切除和裂解,通过RT-PCR,Western- blotting 检测保护性抗原在肌肉中表达情况.结果表明,鸡柔嫩艾美耳球虫pEtK2表面抗原基因和鸡IFN-γ基因均能在注射部位肌肉成功表达,这为鸡球虫DNA疫苗的研制奠定了基础.     

雏鸡感染巨型艾美耳球虫后一些生理生化参数变化

巨型艾美耳球虫是鸡球虫病中致病力较强的虫种,流行区域广,感染率高,成为防治的重点虫种。为此,我们分Ⅰ对照组Ⅱ感染球虫组Ⅲ感染球虫组+添加甜菜碱组Ⅳ感染球虫组+添加马杜拉霉素每组30只小公鸡,Ⅰ.Ⅱ,Ⅳ组按1.5万/只口服接种巨型艾美耳球虫卵囊,接种前一天第Ⅲ组按0.372g 甜菜碱/kg 饲料、第Ⅳ组按0.5g 马杜拉霉素/kg 饲料饲喂。研究其生理和生化指标的动态变化。本试验对雏鸡感染巨型艾美耳球虫及用马拉拉霉素和甜菜碱控制感染所引起的血液中一些生理和生化指标进行了系统的     

斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达

 【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5（MIC-5）和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验（IFA）分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。     

麝香草酚对蛋雏鸡生长性能和免疫功能的影响

试验将30只蛋雏鸡随机分为对照组和试验组,分别饲喂基础日粮和添加0.3mg/kg麝香草酚的日粮;试验期为期21d。试验结束后测定生长性能指标及免疫功能指标。结果表明,试验组蛋雏鸡增重、耗料和料重比与对照组相比差异不显著(P>0.05);试验组蛋雏鸡血清IFN-γ和IL-2含量均显著低于对照组(P<0.01或P<0.05)。结果提示,麝香草酚对蛋雏鸡生长无显著影响,但能调节蛋雏鸡免疫功能。     

球痢灵的毒性试验

本文报告我校研制合成的抗鸡球虫药—球痢灵的毒性和观察结果。试验结果表明:球痢灵,雏鸡口服 LD_(50)=294.7mg/kg,LD_(50)的95%可信限为247.4～351.6mg/kg;用0.0125%球痢灵粉剂混饲,连续饲喂49天,对雏鸡的增重,生长发育及各组织器官等均无不良影响。     

鸡球虫免疫改善其耐药性饲养周期初探

在试验条件下,雏鸡通过球虫苗免疫抵抗野外球虫攻击。以病变记分减少率和相对卵囊产量为主要耐药指标,检测免疫前后粪便卵囊对马杜霉素的耐药性。结果表明:经过3个饲养周期的球虫免疫,雏鸡病变记分减少率(RLS)由28.6%升到66.7%,相对卵囊产量(ROP)从63.2%降为3.9%,从完全耐药转为敏感。     

球虫感染后兔圆小囊病理组织学变化

为研究圆小囊在家兔球虫感染后的病理变化,试验收集自然感染病例的圆小囊,按HE染色石蜡切片方法制作病理组织切片,观察自然感染球虫后家兔圆小囊的组织病理学变化,并与正常圆小囊组织进行比较。结果表明,球虫感染病例的圆小囊集合淋巴小结生发中心反应活跃,粘膜杯状细胞和固有层散在淋巴细胞明显增多,淋巴小结周边及中心多见吞噬细胞成团聚集,或形成大的多核巨细胞,而集合淋巴小结结构基本完整.该研究结果说明圆小囊的局部免疫机制可能在机体抗球虫免疫中起着重要作用。     

抗鸡球虫药配合用药方案的优化及疗效测定

以20日龄罗曼雏鸡随机分为37组,分别于感染前2d饲喂不同配伍的抗球虫药的饲料,每鸡一次经口感染5×104孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊.根据试验鸡的增重、盲肠病变评分及抗球虫指数(ACI)等指标,评定9种抗球虫药经不同配伍后的抗球虫效果;将5种抗球虫药按不同作用机制、不同试验目的及不同浓度配伍后,在海赛克斯鸡群中使用30余d.根据试验鸡的增重和盲肠病变评分指标,评定配合用药的疗效. 结果表明聚醚类抗生素与作用于球虫生活史后期的化学合成药配伍后,达到了抗球虫的增效作用和促进增重的目的,同时大大降低了单一药物的用药剂量,配合用药的增效作用同药物的作用机理、活性峰期及用药浓度有关.