用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较

【目的】进行两种提取方法下马铃薯块茎蛋白质组结果差异分析,并确定最佳马铃薯块茎蛋白质提取方法.【方法】采用酚提取法和三氯乙酸/丙酮沉淀与乙酸铵/甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质,进行2-DE分离,对差异表达蛋白质进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定.【结果】两步沉淀法提取的马铃薯块茎蛋白质较酚提取法获得蛋白质纯度和浓度及蛋白质点数目均明显增加,双向电泳凝胶图谱分辨率较高.质谱鉴定结果表明,两步沉淀法中鉴定的差异表达蛋白质丰度均显著高于酚提取法,并鉴定到一些新出现的蛋白质包括假定的线粒体NAD依赖的苹果酸脱氢酶、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂II前体类型B.【结论】提取马铃薯块茎蛋白质时两步沉淀法优于酚提取法.     

基于DIA LC-MS的烟草根尖蛋白质样品检测分析

【目的】分析数据非依赖性采集高分辨率色谱—质谱技术（DIA LC-MS）对根尖差异蛋白质样品检测的适用性,为深入研究烟草蛋白质组学提供技术支撑。【方法】以6个烟草品种（系）移栽后74 d的根尖组织为试验材料,采用DIA LC-MS法对裂解的蛋白质肽段进行扫描,从而分析该方法对根样组织的适用性。【结果】采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖总蛋白质,能得到横向条带平行性好,电泳条带清晰的蛋白质样品,样品等级评价均达到A级。构建的DDA数据库包含28042条肽段,共鉴定出7084个蛋白质。DIA数据的色谱峰平均数据点为7,平均的峰容量达260,主要肽段的保留时间（iRT）均被检测出,且整体较稳定,在Q值为0.01标准下的一致性评分（Cscore）为0.948,变异系数（CV）中值为11.5%（小于20.0%）,相关系数大于0.9。DIA全息扫描模式下从6个烟草品种（系）的根尖组织中鉴定出的蛋白质数目为4149~5069个。【结论】DIA LC-MS分析鉴定的蛋白质范围广、数量大、可信度高,具有一定的可靠性和稳定性,各项质控指标均能达到试验分析要求,说明DIA LC-MS适用于烟草根尖蛋白质组样品的检测分析。     

野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）低分子量谷蛋白亚基基因的克隆与序列分析

 【目的】旨在从野生二粒小麦中克隆新的低分子量谷蛋白亚基基因。【方法】首先通过SDS-PAGE方法对野生二粒小麦Y5和Y13的低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）进行鉴定，并利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）方法确定其精确分子量。然后采用AS-PCR方法，运用1对LMW-GS特异的引物，分别从Y5和Y13中扩增并克隆了2个亚基的编码基因（命名为LMW-Y5和LMW-Y13）。【结果】测序结果表明，所得基因均为完整的基因序列，包括上游区域、开放阅读框和下游区域，无内含子存在。由核酸序列所推导出的氨基酸序列表明，这两个基因的编码蛋白（命名为LMW-Y5和LMW-Y13）均属于LMW-i型亚基，分子量分别为38.9122 kD和31.8708 kD。其中LMW-Y5的分子量与质谱鉴定的分子量基本一致，表明该蛋白亚基没有翻译后修饰存在。但LMW-Y13的分子量与SDS-PAGE和质谱鉴定结果存在较大差异，其原因可能是在克隆过程中发生了重复区的碱基丢失。【结论】明确了野生二粒小麦两个LMW-i型亚基的分子结构特征，并讨论了LMW-i型亚基分子结构与品质的关系以及在小麦品质改良中的应用潜力。     

小麦叶片蛋白质组的2D-LC分离及Nano LC-MS/MS分析

 【目的】二维液相色谱（2D-LC）与双向电泳（2-DE）技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱（Nano LC-MS/MS）技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS 分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MS BLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）;其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1 551个组分,获得1 867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS 检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。     

家蚕幼虫期和蛹期马氏管差异蛋白质组学分析

【目的】深入了解家蚕幼虫期与蛹期马氏管蛋白质组的变化,为马氏管在不同发育时期的功能研究提供蛋白质水平上的依据。【方法】利用蛋白质双向电泳技术对家蚕5龄第5天及化蛹第1天的马氏管组织进行比较,并采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量差异较大的蛋白点进行肽指纹图谱鉴定,应用GPMAW 8.00软件对NCBI蛋白质数据库中所有来自于P50/Dazao的蛋白质与家蚕9倍基因组预测蛋白质库共同构建本地数据库,对试验采集到的肽指纹图谱进行分析。【结果】共检测到360-430个蛋白点,主要分布在分子质量15-80 kD、等电点4.0-9.5。2个时期共成功鉴定17个表达量有显著差异的蛋白质,其中包括与能量代谢相关蛋白质、热激蛋白、V型H+ ATP合酶、30K蛋白以及与肾脏功能密切相关的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶 2,3-羟基异丁酸脱氢酶等。【结论】本研究中差异蛋白质的发现和鉴定为完全变态昆虫幼虫期与蛹期马氏管的功能差异提供了蛋白质水平上的理论依据。     

不同气候环境中团棵期烟草叶片蛋白质组学分析

【目的】应用比较蛋白组学策略,在蛋白表达水平揭示团棵期烟草对不同气候环境响应的分子机理。【方法】在相同土壤和大田栽培管理条件下,分别在昆明市云南农业大学农场和丽江市玉龙县金庄两个不同气候环境的生态试验点盆栽烤烟品种云烟87,在团棵期进行农艺性状、SPAD值和净光合速率测定,并运用双向电泳和MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术研究烟草叶片蛋白质表达谱的变化。【结果】金庄点烟草具有较高的SPAD值和净光合速率,较大的株高、节间距、茎围、叶宽和叶面积等农艺性状参数。蛋白质组学分析表明,在两个生态点烟草叶片中共检测到39个表达量相差2倍以上的蛋白质点,通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库检索注释了33个蛋白质点,相对于昆明点,金庄点有3个（9.09%）特异表达,7个（21.12%）表达量上调,19个（57.57%）表达量下调的蛋白质点,而昆明点有4个（12.12%）特异表达蛋白质点;功能分类表明,它们分别参与光合作用、防御/抗胁迫、蛋白质合成、矿质代谢等细胞过程。【结论】金庄点烟草具有较高SPAD值,净光合速率,较大的株高、节间距、茎围、叶宽和叶面积等农艺性状参数,这与该点烟草叶片中积累较多高光合效率相关的蛋白质相一致,而昆明点烟草叶片则富集较多的叶绿体蛋白质合成、防御/胁迫以及氮、硫等矿质元素代谢相关的蛋白质。该结果初步阐明了丽江烟区烟叶总糖、还原糖含量较高,总氮、烟碱含量偏低特征的分子机制。     

小麦抗白粉病基因Pm21抗病差异的蛋白质组学研究

 【目的】对小麦白粉菌侵染后的叶片进行差异蛋白质组学研究,以期发现抗白粉病基因Pm21转入后,对抗病机制起重要作用的蛋白。【方法】以对小麦白粉病敏感（百农3217）和对小麦白粉病免疫（W2132-6,携带抗病基因Pm21）的2个小麦近等基因系为材料,分别提取2个材料拔节期接种48 h后的叶片蛋白,应用双向电泳联合质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析Pm21基因转入后差异蛋白表达。【结果】双向电泳后,CBB染色,用ImageMasterTM 2D Platinum软件分析检测出12个差异蛋白点,经过质谱（MALDI-TOF-MS）分析和数据库检索,鉴定出9个蛋白质,其中7个分别与能量代谢、基因调控、防卫和稳定蛋白质相关,参与了增强能量代谢、基因调控、抗氧化、细胞壁加厚和木质化等抗病生理反应。【结论】抗白粉病基因Pm21转入后,材料对白粉菌侵染响应发生变化,脯氨酸富集蛋白等胁迫反应蛋白得到增量表达,这些蛋白可能与小麦抗白粉病有一定相关性。     

软枣猕猴桃受精后子房蛋白表达的2D-DIGE分析

【目的】了解软枣猕猴桃(Actinidia arguta)受精前和受精后（授粉前和授粉后120 h）子房蛋白质组的变化,为阐明猕猴桃属植物双受精的分子机制提供依据。【方法】应用石蜡切片技术、差异凝胶电泳（DIGE）、质谱（MALDI－TOF/TOF）和生物信息学技术,对其授粉前及授粉后120 h的子房形态及蛋白质组变化进行分析。【结果】授粉后120 h,子房中的胚囊已经完成了双受精;用DeCyder V 6.5软件分析,在授粉前、授粉后120 h的子房中共检测到约1 500个蛋白质点,其中55个有差异表达;质谱鉴定了差异2.0倍以上的蛋白质点13个,其中8个获得理想结果,分别属于6种蛋白质;在6种差异蛋白质中,其中5种在授粉后子房中表达上调,只有1种表达下调。【结论】根据软枣猕猴桃受精前后子房差异蛋白表达谱比较,获得了几种与双受精过程相关的蛋白质分子。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其保持系的花药差异蛋白质组学研究

 【目的】对大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其同型保持系NJCMS1B的二胞花粉期花药进行差异蛋白质组学研究，探讨大豆质核互作雄性不育的分子机制。【方法】采用双向凝胶电泳技术对其蛋白质进行分离，凝胶用考马斯亮蓝染色，使用PDQuest软件分析蛋白质图谱，利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对差异表达蛋白进行质谱分析，获得肽质量指纹图谱，用Profound和Mascot软件搜索NCBInr数据库，初步鉴定差异表达蛋白并分析其功能。【结果】 在分子量18.4～116.0 kD、等电点4～7线性范围内，检测到约212个蛋白点，差异表达蛋白点24个。其中10个在NJCMS1A 中出现而在NJCMS1B中缺失，12个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现，2个表达量在NJCMS1B中比在NJCMS1A中明显增强。鉴定出11个差异表达蛋白，其中7个在NJCMS1A中出现而在NJCMS1B中缺失，4个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现。【结论】对主要差异表达蛋白如ACC氧化酶、半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶A亚基、MADS盒蛋白、淀粉分枝酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶等进行功能分析，推测不育系NJCMS1A雄性不育性可能与能量代谢紊乱、细胞程序化死亡（PCD）、乙烯过度合成、淀粉合成受抑制和花器官发育调节基因作用失控等有关。     

基于红外光谱三级鉴别技术的螺旋藻产品品质分析

【目的】利用红外光谱技术分析天然螺旋藻、螺旋藻粉和螺旋藻片的主要成分,为螺旋藻相关产品品质检测和真伪鉴别提供一种快速、准确和有效的方法。【方法】采集2种天然螺旋藻、4种螺旋藻粉和4种螺旋藻片的红外光谱（FTIR）,解析样品的红外光谱、二阶导数光谱和二维相关光谱确定出主要吸收官能团,主体成分以及不同样品之间的差异。通过扫描电镜图像（SEM）、样品蛋白质含量和氨基酸组成的测定结果对红外光谱中的差异进行说明。【结果】天然螺旋藻的红外光谱在1 154/1 156 cm-1、1 079 cm-1和1 039/1 035 cm-1出现3个糖类特征吸收峰;二维相关红外光谱在1 161、1 138、1 083、1 054和1 026 cm-1出现5个强自动峰。螺旋藻粉和螺旋藻片的糖类特征吸收峰形状和位置与天然螺旋藻不同,并且二维相关红外光谱中自动峰减少。天然螺旋藻蛋白质的α-螺旋含量为24.6%,螺旋藻粉和螺旋藻片中α-螺旋含量在15.0%左右。在二维相关红外光谱中天然螺旋藻的酰胺带吸收峰光滑、少分叉,可完全分离的两个尖峰,而螺旋藻粉和螺旋藻片的酰胺带吸收峰宽,分离度不好,并且出现多个分叉峰。蛋白质含量和氨基酸组成测定结果表明螺旋藻产品中蛋白质含量过高,且氨基酸组成与纯螺旋藻的氨基酸组成存在很大差异。【结论】红外光谱技术可以对天然螺旋藻、螺旋藻粉和螺旋藻片的糖类和蛋白成分的差异进行鉴别,并为螺旋藻产品的品质评价和真伪鉴别提供一种有效方法。     

小麦生育后期施用水杨酸对千粒重的影响

[目的]研究水杨酸(SA)在小麦上的增产效应与作用机理。[方法]以大穗大粒型品种兰考矮早8为试材,在小麦灌浆期间,即花后5和18 d分别用1.5、1.0和0.5 mmol/L浓度的水杨酸对植株进行叶面喷施,在小麦成熟时测定其蛋白质、总淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量。[结果]各SA处理均使小麦千粒重有较多提高。花后5 d施用SA的效果高于花后18 d的施用效果,施用浓度均以1.5 mmol/L最佳。SA对直链淀粉的作用大于对蛋白质和支链淀粉的作用。SA提高千粒重的机理是增加了直链与支链淀粉的含量,对蛋白质含量影响不大。[结论]小麦开花后喷施SA可延缓叶片衰老,有利于提高灌浆速率和光合产物的积累,从而提高了籽粒的充实度和千粒重。     

鲮鱼鱼皮胶原蛋白酶解物分子量分布与抗氧化性的研究(英文)

[目的]为了研究鲮鱼鱼皮胶原蛋白水解物的分子量的分布及抗氧化活性。[方法]分子量分布采用分子排阻色谱法和基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),鱼皮用碱性蛋白酶2709处理。[结果]最佳水解条件为:pH 10.0、反应温度55℃、底物浓度为80 g/L、酶和底物比4%,水解时间3 h。两种方法分析水解产物的相对分子质量分布范围为400~1 800 Da,大多数胶原蛋白短肽的分子量在1 400 Da以下。[结论]结果表明,鱼皮水解物是一种潜在的抗氧化物。     

水杨酸对藜豆幼苗抗冷性生理指标的影响

[目的]为了探讨外源水杨酸(SA)在低温胁迫下对藜豆幼苗生理指标的影响。[方法]用0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L SA处理两叶一心的藜豆幼苗,测定低温胁迫下藜豆幼苗的Pro含量、MDA含量、POD活性等生理指标。[结果]除5.0 mmol/L SA使幼苗鲜重下降外,其余浓度SA对藜豆株高和鲜重没有显著影响;随着SA浓度增加,藜豆幼苗叶片中蛋白质含量、Pro含量及POD活性均呈先升后降趋势,而MDA含量呈先降后升的变化趋势,其中2.0 mmol/L SA处理藜豆幼苗叶片中蛋白质含量、Pro含量及POD活性最高,MDA含量最低。[结论]SA可以增强藜豆幼苗的抗冷性,并以2.0 mmol/L SA处理的效果最佳。     

水杨酸对盐胁迫下小麦幼苗生长抑制的缓解效应

[目的]探讨水杨酸（SA）对盐胁迫下小麦幼苗生长抑制的缓解效应。[方法]制备自然（CK）、0、0．5、1．0、1．5、2．0mmol／L SA盐溶液（0．1mol／LNaCl）,研究SA对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响。[结果]盐胁迫条件下SA能提高幼苗叶片的相对含水量、相对干重增长速率、脯氨酸和可溶性蛋白含量,降低膜脂过氧化产物丙二醛含量和质膜透性,缓解了盐胁迫对幼苗生长的抑制。其中,以1．5mmol／L SA缓解效果最好。[结论]利用SA提高小麦幼苗抗盐性是可行的,为建立新的抗盐调控方法奠定理论基础。     

水杨酸对黄瓜种子萌发和幼苗生长的影响

[目的]在生产中合理利用水杨酸。[方法]以津研7号、新夏丰2号黄瓜种子为试材,通过水杨酸浸种处理,研究了水杨酸对黄瓜种子萌发和幼苗生长的影响。[结果]较低浓度的水杨酸浸种处理可以促进黄瓜种子的萌发。黄瓜种子发芽率、发芽势、活力指数、幼苗鲜重等指标在低浓度范围内呈显著增长趋势,其中1.00 mmol/L水杨酸处理效果最显著,而高于1.00 mmol/L的水杨酸则对种子萌发起抑制作用。[结论]水杨酸可以影响与膜相关的一系列生理生化反应,缓解因逆境胁迫而造成的膜伤害。     

水杨酸在切花菊保鲜中的应用

[目的]研究水杨酸（SA）对切花菊衰老的影响。[方法]采用不同保鲜剂（B1：3％蔗糖＋50mg／LSA;B2：3％蔗糖＋100mg／LSA;B3：3％蔗糖＋150mg／LSA;CK：3％蔗糖＋蒸馏水）处理切花菊,测定各处理切花菊衰老过程中鲜重、水分平衡值、糖及蛋白质含量的变化。[结果]B2、B3处理切花菊鲜重和蛋白质含量均极显著高于CK;B1、B3处理切花菊水分平衡值极显著高于CK;]B1、B2处理切花菊糖含量极显著高于CK。[结论]sA可有效减缓切花菊水分、糖和蛋白质损失,保鲜剂B2（3％蔗糖＋100mg／LSA）和B3（3％蔗糖＋150mg／LSA）的保鲜效果较好。     

水杨酸对小苍兰生长及开花的影响

【目的】分析水杨酸(SA)对小苍兰(Freesiarefracta Klatt)生长发育的影响,为利用SA调控小苍兰生长、开花及其种球繁殖提供参考依据。【方法】对盆栽小苍兰进行不同浓度SA水溶液浸泡种球、叶面喷施及浸泡种球+叶面喷施3组处理,以未进行SA处理为对照(CK),测定分析各处理小苍兰的营养生长和生殖生长指标。【结果】低浓度SA(150.0 mg/L)处理可促进小苍兰营养生长及球茎发育,并延长开花天数,高浓度(450.0~600.0 mg/L)SA处理能抑制小苍兰营养生长及生殖生长。在浸泡组中,600.0 mg/L SA处理的小苍兰矮化效果显著(P<0.05,下同),株高比CK降低16.9%,花葶高比CK降低33.8%,但小苍兰叶片受到损伤,且植株开花率降低。在喷施组中,300.0 mg/L SA处理的小苍兰花期比CK提早5 d;150.0 mg/L SA处理的球茎总重量比CK提高27.3%。在浸球+喷施组中,300.0 mg/L SA浸泡种球处理随着叶面喷施SA浓度的升高,大球茎平均重呈明显降低趋势,其中,喷施300.0 mg/L SA处理的大球茎平均重比CK降低11.3%,喷施450.0 mg/L SA处理的株高和花葶高分别比CK降低13.5%和10.3%,且植株叶片生长及开花表现良好。【结论】300.0 mg/L SA浸泡种球+450.0 mg/L SA喷施叶面对小苍兰生长及开花的综合效果最佳,可供小苍兰或其他植物利用SA进行植株生长及开花调控应用。     

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

菠萝蛋白酶降解壳聚糖条件的研究

[目的]为菠萝蛋白酶降解壳聚糖制备壳寡糖提供工艺参数和科学依据。[方法]用DNS比色法测定还原糖的含量,探讨不同条件对菠萝蛋白酶降解壳聚糖的影响。用端基分析法测定壳寡糖的分子量,研究菠萝蛋白酶降解壳聚糖过程中壳聚糖分子量的变化。[结果]菠萝蛋白酶降解壳聚糖的最适pH为7.1,最适温度为53℃,最适酶浓度为0.30 g/L。在最适条件下,降解反应进行6 h以上,可以得到平均聚合度为8,平均分子量为1 306的壳寡糖。[结论]菠萝蛋白酶能有效降解壳聚糖,制备壳寡糖。     

孕酮对雌性小白鼠不同器官中不同分子量蛋白质合成作用的影响

[目的]为深入了解孕酮的蛋白质合成作用奠定基础。[方法]用不同浓度孕酮处理雌性小白鼠,测定其不同器官内不同分子量范围蛋白质的相对含量,探讨孕酮对雌性小白鼠不同组织器官蛋白质合成作用的影响。[结果]不同组织器官内蛋白质主要集中在25～75 kD,而不同浓度的孕酮对雌性小白鼠不同组织器官内蛋白质含量有明显影响。[结论]孕酮诱导子宫、肾上腺和垂体下丘脑上75～250 kD蛋白的合成,诱导垂体下丘脑上15～25 kD蛋白的合成,抑制子宫、肾上腺和垂体下丘脑25～75 kD蛋白的合成。