野油菜黄单胞菌葡萄糖激酶基因的克隆与表达

葡萄糖激酶催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸,是糖酵解的第一步反应,在野油菜黄单胞菌(Xcc)利用碳源代谢及其致病性中起重要作用.为了初步鉴定Xcc葡萄糖激酶基因功能,为研究其利用碳源相关代谢及致病性提供理论依据,以pQE30为表达载体,采用常规PCR技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004基因组上注释为葡萄糖激酶的3个基因(XC_1166、XC_1223和XC_1976)进行了克隆与表达,该3个基因在大肠杆菌JM109中有较高表达量,经Ni2+金属层析柱纯化后分别得到带有3个His的融合蛋白XC_1166-His6、XC_1223-His6和XC_1976-His6,分析表明仅XC_1976的表达产物具有葡萄糖激酶活性,为Xcc8004葡萄糖激酶基因,经测定XC_1976-His6的最适反应温度为45℃,最适pH值为7.1,最适反应条件下比活力为(380.6±1.123) U/mg.     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。     

不同碳源对嗜水气单胞菌生长的影响

【目的】研究嗜水气单胞菌碳源利用能力和代谢过程,筛选对其具有生长抑制作用的碳源。【方法】对比分析不同碳源的液体培养基和饲料浸出液培养基处理下0、12、24、36、48和72h嗜水气单胞菌生长情况。【结果】使用不同碳源的液体培养基中嗜水气单胞菌生长曲线呈先上升后下降趋势,48h活菌数最多,嗜水气单胞菌对碳源利用能力由高到低为蔗糖无水乙醇蜜二糖鼠李糖葡萄糖复合碳源丙二酸冰乙酸;添加不同碳源的饲料浸出液培养基中嗜水气单胞菌生长情况与不同碳源液体培养基相似,嗜水气单胞菌对碳源利用能力由高到低为蔗糖无水乙醇蜜二糖鼠李糖葡萄糖复合碳源丙二酸冰乙酸。【结论】冰乙酸、丙二酸、复合碳源对嗜水气单胞菌生长具有抑制作用,可作为嗜水气单胞菌生态防控用候选碳源。     

UPEC双组分信号系统KguS/KguR调控基因缺失株的构建及其生长特性研究

[目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC) CFT073株的双组分信号系统Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032—c5037基因同源臂的氯霉素抗性基因取代c5032—c5037基因,在温度敏感型质粒p CP20作用下消除氯霉素抗性基因,构建基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,用PCR和基因测序验证基因敲除是否成功,测定有氧和厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养不同时间的菌液D600值。[结果]构建了CFT073Δc5032—c5037,PCR验证及基因测序结果均表明已成功敲除c5032—c5037基因;厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中生长比野生型菌株CFT073缓慢,且差异极显著(P0.01),但在有氧条件下二者的生长无显著差异。[结论]成功构建了基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,并试验证实Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因在厌氧条件下参与α-酮戊二酸的利用,为进一步研究Kgu S/KguR在UPEC中的代谢适应机制奠定了基础。     

猴头菌对木质纤维素的降解

实验测定了4个猴头菌株在4种培养基质上生长时的营养规律。结果表明,猴头菌在废棉及棉籽壳基质上生长时子实体转化率较高,能够利用纤维素、半纤维素和木素为碳源。纤维素是猴头菌子实体阶段的主要碳源;猴头菌对不同纤维素含量的培养基质的利用率有显著不同;猴头菌生长期间能向基质中释放胞外 CMC 酶、FP 酶和 HC 酶,3种酶的活性高峰均出现在子实体生长阶段。     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

大丽轮枝菌微菌核发育相关基因VdPKS的功能分析

为阐明与大丽轮枝菌微菌核发育相关的聚酮合成酶基因VdPKS的功能,在前期获得VdPKS被单拷贝T-DNA插入的微菌核发育异常突变体2H3的基础上,通过基因敲除和回补技术,经分子鉴定和表型验证,获得了2株VdPKS基因敲除突变体和3株回补突变体。研究发现野生型菌株孢子在接种到PDA培养基上培养的第6 d开始积累黑色素,而此时VdPKS基因的表达量也最高。敲除突变体虽然没有形成黑色素,却也观察到微菌核的初始结构,表明VdPKS基因不是微菌核形成的必须基因,仅参与微菌核发育后期黑色素的形成。致病力测定结果表明VdPKS基因与菌株的致病力无关。杀菌剂嘧菌酯和咯菌腈对敲除突变体菌丝生长的抑制率相对于野生型菌株和回补突变体有显著提高,表明VdPKS基因与大丽轮枝菌的抗逆性相关。     

菜豆晕疫病原菌甘油激酶基因敲除突变体的构建与表型分析

以菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)NPS3121株系为出发材料,根据Gen Bank中登录的1448A甘油激酶(glycerol kinase,GK)氨基酸序列设计同源引物,通过PCR克隆NPS3121 GK基因,序列全长为1 506 bp,可编码1条含501个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,NPS3121 GK包含469个氨基酸,相对分子质量为55 800,富含α–螺旋结构,等电点为5.44。通过整合突变的方式构建了NPS3121 GK敲除突变体,敲除突变体与野生型相比,在M9培养基中生长速率降低18%,在KBM培养基中生长速率降低16%。敲除突变体中甘油浓度较野生型提高了6倍。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因（rpoZXcc）突变导致细胞生长减慢

ω（Omega）亚基是组成细菌RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）核心酶的5个亚基（2α、β、β′andω）中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株（Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004）基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc（ORF编号为XC0957）。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

热驯预处理对热胁迫下油菜下胚轴一些生理指标变化的影响

[目的]探讨热驯预处理对热胁迫下油菜下胚轴的影响。[方法]以油菜幼苗下胚轴为研究材料,通过测定热驯（37℃）、经热驯再热胁迫（37℃→44℃）和直接热胁迫（44℃）下油菜幼苗下胚轴生长量、抗坏血酸（ASA）、丙二醛（MDA）、相对含水量（RWC）及相对电导率的变化,研究热驯预处理对热胁迫下油菜幼苗下胚轴生理的影响。[结果]随着胁迫温度的升高,油菜下胚轴的生长量降低,下胚轴受损程度增加。经热驯预处理再高温胁迫,油菜下胚轴生长量、抗坏血酸含量和相对含水量明显高于直接高温胁迫的,丙二醛含量、细胞膜受损和膜脂过氧化程度则明显低于后者。[结论]热驯提高了耐热性,使下胚轴的生长得到了一定保护。     

幼苗期油菜几何造型研究

[目的]研究幼苗期油菜的几何造型。[方法]通过对幼苗期油菜的形态结构和生长过程的观测分析,提出了基于形态结构特征参数的幼苗期油菜三维形态数学模型及其可视化方法。根据油菜各器官的形态结构特征提取了不同的控制参数,并利用3次Bézier曲面生成大小各异的油菜叶片与叶柄模型,同时采用上下底面积不同的圆柱体作为主茎模型,最后通过旋转、缩放、拼接等操作实现了幼苗期整株油菜的三维重建。[结果]该方法具有一定的可控性,简单方便,可快速构建幼苗期油菜几何模型。[结论]为油菜形态模型研究提供了参考。     

黄花棘豆水提液对油菜化感作用机理的初步研究

以油菜为受体,采用室内培养皿法和生化分析法,初步研究了草原有毒植物黄花棘豆水提液对受体油菜的化感作用.结果表明:黄花棘豆水提液对油菜种子的萌发和幼苗生长具有化感作用,具体表现为低浓度促进,高浓度抑制.高浓度的黄花棘豆水提液可导致油菜幼苗根部结构发生变化,抑制油菜根尖的有丝分裂,推迟分裂时间;同时还发现黄花棘豆水提液可降...     

油青四九菜心细胞核不育系转育研究

[目的]探索油青四九菜心细胞核不育系的转育。[方法]以法45抗热大白菜不育系为不育源,通过常规杂交转育得到油青四九菜心细胞核不育系、新甲型两用系和临时保持系。[结果]用可育品系与雄性不育系中不育株和甲型两用系中不育株杂交,以及新甲型两用系中可育株正反交,测定15个菜心可育品系基因型均为MsfMsf。按雄性不育系杂交转育方案,育成了大白菜细胞质油青四九菜心的新甲型两用系,雄性不育系和临时保持系。按照回交转育方案,完成了大白菜细胞质和菜心细胞质4个世代雄性不育系的转育,其后代雄蕊育性分离比例完全符合回交转育模式。[结论]在雄性不育系的转育过程中,注意同型株的选择,会有很好的转育效果。     

不同铁源对水培油菜产量品质影响的研究

为解决水培中的铁源问题,利用不同铁源水培油菜。结果表明:当营养液中各养分配比相同,pH控制在5.5～6.5时,用EDTA-Fe与FeC_6H_5O_7处理对油菜生长良好,两者差异不显著。用FeC_2H_5O_7处理的油菜:其体内叶绿素含量达EDTA-Fe处理的99.8％,H_2O_2酶活性超出EDTA-Fe处理的4.2％,根活力达EDTA-Fe处理的98.7％,Fe含量达EDTA-Fe处理的99.3％,用FeC_6H_5O_7处理的油菜产量最高,并且各项指标显著高于无机铁源。说明用FeC_6H_5O_7,可代替价格较高的EDTA-Fe,在无土栽培中应用。     

白菜型油菜亚种间杂种的合成

采用蕾期人工去雄与辅助授粉的方式,以白菜型油菜十月红菜薹和黄芽白进行正反交,以较高的频率获得了杂种后代。杂种后代叶型、株型和花等形态均表现为双亲的中间型。叶片颜色比黄芽白更深,均偏向十月红菜薹的紫红色;植株表现出较强的杂种优势,株高大于双亲,产生大量的分枝,角果数远多于双亲。杂种后代花器官发育正常,可育花粉为99%以上,且自交结实率较高。花粉母细胞减数分裂比较正常,95%的花粉母细胞在终变期所有染色体进行同源配对,形成10个二价体,减数第二次分裂中期有部分出现染色体落后现象。杂种后代极强的杂种优势和较好的自交结实性为进一步选育具有优良特性的新型白菜型油菜提供了可能。     

白菜型冬油菜配方施肥研究

2010年在天水市秦州区进行了冬油菜“3414”试验,结果表明,冬油菜产量随氮、磷、钾单因素肥料施入量的增加呈先增产后减产趋势,以氮肥增产效果最好,增产率4.61%.通过建立冬油菜产量与 N、 P、 K 施肥量回归方程,得出最大施肥量为 N 172.5 kg/hm2、 P2O581.6 kg/hm2、 K2O 141.6 kg/hm2,冬油菜产量为3060.60 kg/hm2;最佳施肥量为 N 83.7 kg/hm2、 P2O527.3 kg/hm2、 K2O 25.8 kg/hm2,冬油菜产量为2862.75 kg/hm2