根癌农杆菌介导反义蜡质基因的水稻遗传转化

通过根癌农杆菌介导法.将水稻反义蜡质基因导入6个水稻品种(系)幼胚的愈伤组织.这些愈伤组织经连续两次25～50mg/L潮霉素抗性筛选,获得抗性愈伤组织的转化频率为30.75%～59.09%,经分化培养,不同品种的绿苗转化频率分别为3.85%～8.97%.分化成苗的植株经GUS检测,80%以上的植株叶片呈阳性反应,显示蓝色.部分呈阴性反应的植株经PCR检测,也能扩增出外源基因相应的DNA片断,结果证明外源基因已整合到转基因植株中.     

籼稻不同品种的遗传转化和植株再生

用携带水稻蜡质基因反义 RNA片段的 p1 3 W4质粒的根癌农杆菌 EHA1 0 5 ,分别感染籼稻品种龙特甫 B、协青早B、珍汕 97B和 -3 2 B的幼胚愈伤组织 ,经共培养和在潮霉素 2 5～ 5 0 mg/L浓度下的二次筛选后 ,获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织 ,抗性愈伤组织的频率在 2 0 .1 %～ 2 7.1 %之间 ;抗性愈伤组织经分化培养 ,分化频率在 1 2 .0 %～ 2 1 .2 %。品种间绿菌分化情况存在较大差异 ,龙特甫 B的抗性愈伤组织分化成绿苗的频率为 8.8% ;珍汕 97B的抗性愈伤组织虽能分化 ,但是 ,无法获得绿苗。对转基因植株分别进行了 GUS活性测定和 PCR检测 ,结果显示 :获得的转基因植株 ,92 %的植株GUS检测呈阳性反应 ,并能正常结实 ,在 T1种子的胚乳中也能检测到 GUS染色的分离 ,证明外源基因确已导入这些植株中 ,而且 ,能正常遗传。在抗性愈伤组织的分化中 ,试验了潮霉素对分化的影响 ,结果显示 :不添加潮霉素 ,能明显地提高绿苗频率 ,但转基因植株的可靠性也随之下降。     

灿稻不同品种的遗传转化和植株再生

用携带水稻蜡质基因反义RNA片段的p13W4质粒的根癌农杆菌EHA105，分别感染灿稻品种龙特甫B、协青早B、珍灿97B和Ⅱ-32B的幼胚愈伤组织，经共培养和潮霉素25～50mg/L浓度下的二次筛选后，获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织，抗性愈伤组织的频率在20.1%～27.1%之间；抗性愈伤组织经分化培养，分化频率在12.0%～21.2%。品种间绿菌分化情况存在较大差异，龙特甫B的抗性愈伤组织分化成绿苗的频率为8.8%；珍汕97B的抗性愈伤组织虽能分化，但是，无法获得绿苗。 对转基因植株分别进行了GUS活性测定和PCR检测。结果显示：获得的转基因植株，92%的植株GUS检测呈阳性反应，并能正常结实，在T1种子的胚乳中也能检测到GUS染色的分离，证明外源基因确已导入这些植株中，而且，能正常遗传。在抗性愈伤组织的分化中，试验了潮霉素对分化的影响，结果显示：不添加潮霉素，能明显地提高绿菌频率，但转基因植株的可靠性也随之下降。     

农杆菌介导法获得匍匐翦股颖转GO基因植株

以匍匐翦股颖2个品种Pent A-4和L-93的成熟种子为外植体材料,附加2,4-D 4.0 mg/L和KT 0.05 mg/L的稍作修改的MS培养基为愈伤组织诱导和继代培养基.琼脂条的用量为16 g/L时,50%以上的愈伤组织呈浅黄色或白色、干燥、颗粒状结构.颗粒状愈伤组织经过连续3次继代培养后,其绿苗分化率保持在60%以上.以颗粒状胚性愈伤组织为受体材料,用农杆菌介导法将含有葡萄糖氧化酶(GO)基因和新霉素磷酸转移酶基因(NPT II)的重组质粒导入匍匐翦股颖.愈伤组织经农杆菌LBA4404/pBGO感染和共培养后,在附加G-418 60 mg/L的愈伤组织继代培养基上选择到具有卡那霉素抗性的愈伤组织.抗性愈伤组织分化的绿苗在附加G-418 30 mg/L的绿苗分化培养基上进行筛选,获得了抗性再生植株.试管植株的叶片经淀粉-碘化钾显色反应,检测到转GO基因植株产生的过氧化氢.PCR分子检测结果证明,GO基因已整合到转化植株的基因组中.抗病性鉴定结果显示,转GO基因植株抗水稻纹枯病.     

农杆菌介导水稻幼胚转化体系的建立

利用根癌农杆菌介导的转化方法对 3个粳稻品种的幼胚进行转化。在对影响根癌农杆菌转化水稻效率的多种因素进行比较研究后 ,优化转化条件 ,改进技术 ,建立了农杆菌介导的水稻幼胚转化体系。利用该体系 ,水稻品种秀水 11号的幼胚经预培养 4～ 7d得到的愈伤组织 ,用农杆菌EHA10 5 /pCAMBIA13 0 1感染后 ,筛选出潮霉素抗性愈伤组织并获得转化植株 ,潮霉素抗性愈伤组织获得率为 70 .76%。GUS染色及转基因植株总DNA的PCR检测结果表明 ,T -DNA上的外源基因已整合进了转基因水稻基因组中。     

用根癌农杆菌介导获得籼稻转基因植株

用携带p13W4质粒的根癌农杆菌EHA105感染籼稻龙特甫品种的幼胚愈伤组织，经共培养并在潮霉素25－50mg/L浓度条件下筛选2－3次，获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织，其愈伤组织转化频率为25.3%,将抗性愈伤组织转入分3化培养基培养形成植株，经GUS活性测定和PCR检测，结果证明外源基因确已导入这些转基因植株之中。     

共转化获得无抗性标记的转反义蜡质基因籼稻

【目的】利用转基因技术将反义蜡质基因导入籼稻成熟胚愈伤组织中,改良籼稻稻米直链淀粉含量。【方法】用根癌农杆菌介导的方法将p13W8质粒（含反义蜡质基因）和pCAMBIA1300质粒（含抗潮霉素抗性基因）对2个籼稻品种的成熟胚愈伤组织进行遗传共转化。【结果】供试材料愈伤组织继代培养18～24 d后具有较高的转化频率和分化频率,可作为共转化的良好受体;抗性愈伤组织PCR检测结果表明,抗潮霉素抗性基因的阳性检测率为97.6%,反义蜡质基因的阳性检测率为27.1%。在46株转基因潮霉素抗性植株中,反义蜡质基因阳性株为5株,占转基因植株的10.9%。经PCR检测,发现上述4个株系T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因片段的分离,从286个T1单株中筛选到了39个单株只带反义蜡质基因片段,而无潮霉素抗性基因的转基因植株,占T1单株总数的13.6%。部分转反义蜡质基因植株种子的直链淀粉含量有不同程度的降低。【结论】通过农杆菌介导的遗传共转化方法,将反义蜡质基因Waxy导入籼稻成熟胚愈伤组织,获得了直链淀粉含量明显降低的仅含反义蜡质基因籼稻株系。     

草地早熟禾转葡萄糖氧化酶基因植株的获得

以从大青山草地早熟禾、超级伊克利和午夜等3个草地早熟禾品种的成熟种子诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织为受体材料,应用农杆菌介导法将含有葡萄糖氧化酶基因(GO)和新霉素磷酸转移酶基因(NPT II)的重组质粒导入草地早熟禾。愈伤组织经携带pBGO质粒的农杆菌LBA4404的感染和共培养后,转到添加筛选剂G-418 20~50 mg/L的愈伤组织继代培养基上进行筛选,选择对卡那霉素具有抗性的愈伤组织,进而获得再生植株。试管植株的叶片经淀粉-碘化钾显色反应后,检测到转基因植株中产生了过氧化氢。PCR分子检测证明,GO基因已整合到转化植株的基因组中。抗病性鉴定结果显示,转GO基因植株对水稻纹枯病具有不同程度的抗性。     

超级稻DAD1基因正反义植物表达载体的构建及转化菊花的研究

将水稻DAD1基因插入Ti质粒,构建成该基因的正反义植物表达载体pWM-DAD1,pWM-antisense DAD1,转入根癌农杆菌LBA4404后,利用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,经Hyg抗性筛选,并诱导愈伤组织和分化成苗,得到转基因菊花植株,通过PCR检测,从部分转基因植株中检测出预期的目的基因的存在.     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

用基因枪法将Bt杀虫基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。本研究采用基因枪法转化上述胚性愈伤组织 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (5 0 μg·m L-1)的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (2 5 μg· m L-1)的分化培养基上诱导抗性芽。GUS酶活性检测和对基因组 DNA作 PCR检测结果均为阳性 ,证明外源目的基因 (Bt)已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的 GUS酶活性及 PCR检测正在进行中     

用农杆菌将Bt基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。通过采用农杆菌共培养法转化上述胚性愈伤组织,在附加羧苄青霉素Ｃｂ（５００ｕｇ／ｍＬ）和卡那霉素Ｋｍ（５０ｕｇ／ｍＬ）的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选,在附加羧苄青霉素Ｃｂ（５０ｕｇ／ｍＬ）和卡那霉素Ｋｍ（２５ｕｇ／ｍＬ）的分化培养基上诱导抗性芽。ＧＵＳ酶活性检测和ＰＣＲ检测结果均为阳性,证明外源目的基因（Ｂｔ）已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的ＧＵＳ酶活性及ＰＣＲ检测正在进行中。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性

将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)编码harpinxoo的hrfAxoo基因连接到双元载体pBI121上，构建成含hrfAxoo基因的植物表达质粒pBMH9。以粳稻R109成熟胚诱导愈伤组织，由根癌农杆菌EHA105介导，将含有hrfAxoo基因的重组质粒pBMH9转化水稻愈伤组织。用G-418抗生素做抗性筛选，产生抗性愈伤组织的频率为85％，转化植株的再生频率为53％。根据hrfAxoo基因两端序列和pBMH9中外源片断的旁侧序列设计2对引物，通过PCR扩增验证转化水稻中的靶基因序列。对部分转基因水稻进行RT—PCR和Northern blot分析，结果显示hrfAxoo基因在转基因水稻中能正常表达。抗病性鉴定结果表明，转基因水稻在，ID、T1和T2代对水稻白叶枯病有较好的抗性；在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。因此，本研究获得对水稻白叶枯病抗性提高的转基因水稻。     

番茄BADH2基因转化水稻

用分子生物学手段,构建含番茄BADH2基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴幼胚诱导的愈伤组织,获得了303块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织。获得1 059个转化植株。随机选择115个T0植株进行Hyp离体叶片筛选,结果表明,绝大多数植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假阳性。     

白桦抗虫基因转化的初步研究

用根癌农杆菌介导法对白桦（Betula platyphylla)进行转化，获得了转化再生植株。卡那霉素抗性愈伤组织产生率达10%-22%，抗性不定枝的生根率达80%以上。经分子生物学检测，在卡那霉素抗性转化植株中，有34%检测出GUS活性，76.5%的卡那霉素抗性植株的Southern斑点杂交呈阳性反应。初步证明，抗虫基因已转入白桦中。     

抗菌肽Shiva A基因导入杂交水稻恢复系明恢63的初步研究

利用农杆菌介导法将抗菌肽Ｓｈｉｖａ Ａ 基因导入杂交水稻恢复系明恢６３ 成熟胚诱导的愈伤组织中，并再生植株。经ＰＣＲ检测分析证明Ｓｈｉｖａ Ａ 基因已整合到再生植株的基因组中。     

利用反义基因沉默策略构建水稻突变体库及突变体筛选

尝试利用鸟枪反义基因沉默策略构建水稻突变体库．利用水稻反义cDNA文库转化粳稻品种中花11，获得了来源于105块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织的1486个转化植株．随机选择来源于11个独立转化系的335个T0植株进行Hm离体叶片筛选，结果表明所有植株均呈抗性，并且与PER检测结果相吻合，说明T0植株中不存在假转化体．Southern blot分析结果表明T0植株大部分为单位点整合．T0及T1代转化植株均呈现了一些形态变异，如矮化、无分蘖或多分蘖、结实率降低、粒型或穗型改变、小穗结构改变等．利用Hm离体叶片筛选法对部分T1群体进行筛选，得到了1个变异性状与Hm抗性共分离的突变体，该突变体的变异表型为结实率比非转化对照下降约50％，每穗颖花总数比对照减少约40％，二者的总效应导致突变体单穗产量比对照约下降70％．     

基因枪导入法培育抗虫水稻

以含潮霉素抗性基因，GUS基因和雪花莲凝集素（GNA）基因的pWRG1515和pRSSGNA1为供体DNA，利用基因枪法转化上农香糯成熟胚诱导的愈伤组织，经抗性培养基筛选，从轰击的135块愈伤组织中得5株转 基因植株，GUS检测和PCR分析表明，外源基因已转入并整合到水稻基因组DNA上。