转Cry1A(b)基因抗虫水稻的获得及鉴定

利用农杆菌混合液介导的共转化法,研究不同浓度的农杆菌混合液浸染5种水稻品种的愈伤组织,进而获得共转化再生植株。对转基因植株进行叶片潮霉素抗性检测和螟虫田间抗性鉴定的结果表明,农杆菌混合液浓度OD600为0.6左右时,其浸染能力较强;5个品种中以浙粳27的再生效率最高。转基因植株叶片经潮霉素抗性检测,潮霉素阳性率为78.13%,经PCR检测转基因植株Cry1A(b)基因阳性率为15.11%。自然抗性鉴定结果表明:Cry1A(b)基因阳性的转基因植株对稻纵卷叶螟具有很好的抗性。基因分离的鉴定结果表明:HPT基因与Cry1A(b)基因在共转化转基因植株的后代中发生了分离。     

农杆菌介导系统获得性抗性调节基因(NPR1)转化罗汉果的研究

以罗汉果子叶为受体,通过农杆菌介导法,将从拟南芥中克隆到的NPR1基因导入罗汉果.经抗生素筛选、PCR检测和Southern杂交分析,结果表明:NPR1基因已经整合到罗汉果基因组.通过外植体不同分化阶段的抗性筛选,获得转基因植株.在烟草花叶病毒接种6周后,转基因植株的发病程度明显低于非转基因植株.     

菊花转基因研究进展

从菊花遗传转化受体的建立和菊花转基因体系的建立两方面综述了建立菊花的遗传转化体系的研究情况，后者包括抗生素的选用、转化再生植株的筛选、共培养时间、农杆菌菌株的选择。同时对近10年来在菊花遗传转化方面所作的研究工作进行了综述，包括转NPTⅡ基因和GUS基因，转改变花色、花型、花期基因，转抗病、抗虫、抗病毒基因和提高耐寒性基因。提出了转基因菊花存在的问题，并就其前景进行了展望。     

抗逆转基因旱稻转化体系的优化

以粳糯型常规旱稻品种"冀旱糯3号"为受体材料,利用农杆菌转化法将bar基因和lea-1基因转入旱稻细胞,建立了适用于旱稻的高效转化体系,最终获得转基因植株,并对转基因植株进行PCR检测。结果表明:当农杆菌浓度(以D_(600 nm)表示)为0.2时,转化效果最好。在筛选抗性愈伤时,除草剂的最佳浓度为40 mg/L,对抗性愈伤组织进行预分化能提高其分化率,对转基因植株进行分子检测,优化后的转化率提高到37.5%。     

根癌农杆菌介导转录因子CBF1基因对菊花的转化

利用根癌农杆菌介导法对菊花品种'小金黄'叶片进行遗传转化,研究影响菊花转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系.结果表明:2 d的预培养,OD600值约为0.5的农杆菌菌液添加50 mg/L AS,侵染时间3 min,2 d的共培养,从分化培养基获得的抗性芽在生根培养基MS+0.4 mg/L NAA+10 mg/L Km+100 mg/L Cef上进行延迟筛选,有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,CBF1基因已整合到菊花基因组中,共获得18株转基因植株,在抗性株系中PCR阳性率为36.7%.     

cNHX1基因转化草莓的研究

[目的]探讨将完整的含柑橘cNHX1基因转化为草莓植株。[方法]以弗吉尼亚草莓品种为试材构建了含柑橘cNHX1基因的植物表达载体,并进行了酶切鉴定,然后将表达载体导入农杆菌EHA105中,获得了工程菌株;利用农杆菌转化法,把cNHX1基因转化成草莓植株,并利用PCR方法鉴定了转化植株。[结果]利用农杆菌转化法获得了转cNHX1基因,通过进一步利用含Kam的平板进行筛选,获得了纯合的转基因植株;对获得的转基因草莓植株提取叶片DNA,利用引物F01和R02进行扩增,结果在草莓基因组中可以扩增出1.63kb的目的条带,证明cNHX1基因已经整合到草莓基因组。[结论]为获得耐盐程度显著提高的转基因草莓奠定了初步基础。     

农杆菌介导葡萄糖氧化酶基因转化油菜

以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体材料,采用农杆菌介导法进行葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)基因的转化,经卡那霉素抗性筛选获得大量的不定芽.PCR检测结果显示其中22株呈阳性.淀粉-KI染色结果表明在转基因植株中检测到H2O2.在转基因植株×非转基因植株(F1代)中,卡那霉素抗性筛选显示86%的株系呈现典型的孟德尔单基因显性遗传.F1代盛花期茎秆菌核病活体接种结果证实,转基因植株后代菌核病抗性明显提高.证实GO基因已转入油菜植株中并得到有效表达.     

农杆菌介导的细菌阿特拉津氯水解酶基因对水稻的遗传转化

 研究构建了植物表达载体p1301-atzA,使来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)AD1菌株的阿特拉津氯水解酶基因atzA受控于CaMV35s启动子下表达。用农杆菌介导法将植物表达载体p1301-atzA导入粳型保持系津稻107中,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。转基因植株总DNA经PCR和Southern检测表明atzA基因已整合到水稻的基因组中。对转基因植株进行除草剂阿特拉津抗性检测,在喷施浓度为0.133％的阿特拉津溶液后,对照植株和敏感植株死亡,而转基因植株表现出对阿特拉津的抗性,     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测     

去除标记基因的水稻转基因研究

以p1300(含潮霉素抗性标记基因)和p13W8(含反义蜡质基因)为供体DNA，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的方法，对水稻品种寒丰B的幼胚愈伤组织进行共转化，获得35份转基因植株。经PCR检测，有5份检测到反义蜡质基因和潮霉素抗性基因共存。在其T1代材料中，通过PCR检测获得24份只带有反义蜡质基因而无潮霉素标记基因的转基因植株。结果证明：在共转化植株后代中，通过筛选可获得无抗性标记基因的水稻转基因植株。     

转pt4CL1基因毛白杨的生长分析

为了分析木质素在不同转基因毛白杨(Populus tomentosa Carr.)植株中的变化情况,对1年生转正义pt4CL1基因毛白杨、转反义pt4CL1基因毛白杨和非转基因毛白杨(741对照)植株的生长状况和组织化学结构进行了研究。结果表明,转反义pt4CL1基因毛白杨的叶片数、株高、茎粗等明显优于对照,而转正义pt4CL1基因植株没有明显变化;转正义pt4CL1基因毛白杨的木质化程度明显高于对照,而转反义毛白杨的较对照低。     

Improvement of Drought Tolerance in Transgenic Tobacco Plants by a Dehydrin-Like Gene Transfer

A full-length cDNA of dehydrin BcDh2 from Boea crassifolia and its antisense nucleotide sequence have been transferred into tobacco (Nicotiana tabacum) NC89 under the control of a caulifower mosaic virus 35S promoter. Under a progressive water stress, photosynthetic rate, transpiration rate and stomatal conductance of the sense and antisense plants reduced, and those of the control reduced much more. Photosynthetic rate, transpiration rate and stomatal conductance of all plants tested increased significantly 24 hours later after recoveried water supply, and those of the sense and antisense plants were higher than control. These indicated that overexpression of a dehydrin gene in tobacco may improve tolerance to water stress for plants, however, antisense BcDh2 gene in transgenic plant did not influence physiological conditions. The results of germination experiment of the transgenic seeds showed that on MS medium with different concentration PEG (8000), sense seed could more endure drought than control, while antisense seed was sensitive to drought. The results suggested that the overexpression of a dehydrin gene in tobacco might improve the tolerance to water stress for plants.     

植物人工启动子研究进展

以矮牵牛无菌苗叶片作为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系。通过农杆菌介导法将水稻反义类黄酮3''-羟化酶基因（F3''H）转入矮牵牛中,抗性植株经PCR 检测均为阳性植株,初步表明反义F3''H 基因已整合到矮牵牛基因组中;对阳性植株进行半定量RT-PCR 检测,与非转基因植株相比,阳性植株中F3''H 基因的表达减弱,表明导入的反义F3''H 基因抑制了内源基因的表达。     

转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性

将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)编码harpinxoo的hrfAxoo基因连接到双元载体pBI121上，构建成含hrfAxoo基因的植物表达质粒pBMH9。以粳稻R109成熟胚诱导愈伤组织，由根癌农杆菌EHA105介导，将含有hrfAxoo基因的重组质粒pBMH9转化水稻愈伤组织。用G-418抗生素做抗性筛选，产生抗性愈伤组织的频率为85％，转化植株的再生频率为53％。根据hrfAxoo基因两端序列和pBMH9中外源片断的旁侧序列设计2对引物，通过PCR扩增验证转化水稻中的靶基因序列。对部分转基因水稻进行RT—PCR和Northern blot分析，结果显示hrfAxoo基因在转基因水稻中能正常表达。抗病性鉴定结果表明，转基因水稻在，ID、T1和T2代对水稻白叶枯病有较好的抗性；在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。因此，本研究获得对水稻白叶枯病抗性提高的转基因水稻。     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

根癌农杆菌介导mBt886Cry3Aa转化菊花及对菊天牛毒杀作用

 【目的】将对鞘翅目害虫有毒杀作用的基因 mBtCryAa 转入菊花;并测定转基因菊花对靶标害虫—菊天牛的毒杀效果;为防治鞘翅目害虫提供新途径。【方法】以菊花为材料;确定茎段最适分化培养基和不定芽最佳生根培养基;卡那霉素最适筛选浓度;头孢噻肟钠最适抑菌浓度;通过农杆菌介导法完成mBtCryAa的遗传转化;利用转基因菊花与人工饲料混合对菊天牛 龄幼虫饲喂进行室内生物测定。【结果】经卡那霉素筛选和 PCR 检测;最终得到 株转基因菊花;选取长势健壮的 株转基因菊花混合人工饲料喂养菊天牛 龄幼虫;结果表明菊天牛 龄幼虫取食转基因菊花后的死亡率与对照幼虫（CK）死亡率差异显著。【结论】室内生物测定表明转基因菊花对菊天牛 龄幼虫具有较强的毒杀作用。     

根癌农杆菌介导反义PG基因对桃的遗传转化

以白粉桃茎段为材料,通过根癌农杆菌介导用反义多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因对桃进行了遗传转化.将预培养3d的受体材料经根癌农杆菌菌液(D600=0.4)浸染10min后共培养60h,转移至分化培养基MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+50mg·L-1卡那霉素+250mg·L-1头孢氨苄青霉素上诱导产生不定芽,将抗卡那霉素的不定芽先后在含有50mg·L-1卡那霉素的生长、增殖和生根培养基上继续选择,获得了完整植株,经PCR检测初步证明反义PG基因已导入桃中.     

Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi (Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis) and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.     

转BpGH3.5基因白桦优良株系选择

目的植物生长素酰胺合成酶基因家族（GH3s）为典型的植物生长素初级/早期响应基因，多数家族基因可通过调节植物体内游离IAA的浓度实现对生长发育的调控。故此，采用基因工程育种技术将BpGH3.5正义链、反义链导入白桦基因组中，预期获得速生转基因白桦新品种。方法以7年生白桦转BpGH3.5基因的54个正、反义链株系及对照（WT）株系为研究对象，测定树高、胸径及材积等生长指标，采用PCR及qRT-PCR技术分别检测转正、反义链各5个株系目标基因的遗传稳定性及相对表达量，同时采用ELISA技术测定游离IAA含量。结果PCR扩增显示，转基因株系中的nptⅡ外源基因均为阳性；qRT- PCR分析显示，5个转正义链株系中BpGH3.5基因表达量均显著高于WT株系，相反，5个转反义链株系中内源BpGH3.5基因表达量均显著下调，即BpGH3.5反义链导入白桦基因组后干扰了白桦BpGH3.5基因的表达。内源游离IAA含量测定显示，转BpGH3.5正义链株系的IAA含量低于或显著低于WT株系，5个转反义链株系均显著高于WT株系（P < 0.01），其IAA含量均值高于WT株系的52.26%。7年生转BpGH3.5白桦的树高、胸径及材积生长性状在株系间的差异达到了极显著水平（P < 0.01），在树高、胸径及材积生长指标高于群体均值的转基因株系中，转反义链株系占80%以上，认为BpGH3.5反义链导入白桦基因组中通过抑制BpGH3.5基因的表达，削弱IAA氨基酸化的能力，进而释放更多游离IAA从而促进白桦的生长。采用主成分分析法，选出10个速生的转反义链株系，这些株系的树高、胸径及材积均值较群体均值分别高8.55%、19.28%、50.42%，材积的平均遗传增益为36.3%。上述入选株系为后续转BpGH3.5白桦的环境释放提供参考。结论BpGH3.5反义链导入白桦基因组中，能够抑制BpGH3.5基因的表达，同时释放更多游离IAA而促进白桦的生长，采用主成分分析法，选出10个优良株系。