利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道.本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生.与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用.经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法.     

西瓜细菌性果斑病菌快速免疫PCR检测

对种子携带的西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli)进行简单抽提和纯化,不经过DNA提取而以病原菌为模板进行PCR检测.结果显示,对带菌种子提取液采用直接PCR法最低检出限为3600个细菌/mL,而免疫PCR最低检出限可达到600个细菌/mL.免疫PCR法可以有效富集病原后再扩增,方便快速,成本低,灵敏度高,适用于种子携带微量的西瓜细菌性果斑病菌的快速鉴定.     

玉米样品中转基因玉米Bt176含量检测

根据其检测特异性,转基因产品检测技术可分为筛选、基因、构建和转化体特异性检测四类.由于转化体特异性检测方法的具有高度特异性,目前,一些发达国家对于转基因产品检测方法正逐步过渡到转化体特异性序列的检测方法.本研究针对转基因玉米Bt176的外源基因3'端与玉米基因组DNA相接区序列设计具有转化体特异性的引物和荧光探针.利用实时荧光定量PCR,以已知Bt176含量样品为标准样品建立内外源基因标准曲线,利用该标准曲线对多个玉米样品Bt176玉米成分含量进行检测,结果显示该方法检测结果准确,检测特异性强,Bt176玉米检测极限浓度达到0.001 ng/μL.同时该方法操作简单,适合转基因样品大批量检测.     

多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分

应用多重PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测转基因番茄华番1号中的转基因成分。对番茄中特异的PG内源基因、华番1号中含有的CAMV35S、NOS和NPTII外源基因进行多重PCR扩增,将扩增产物测序验证。利用DH-PLC分离多重PCR产物,建立了多重PCR-DHPLC技术检测转基因番茄的方法;将样品进行稀释,确定了该方法的检测灵敏度。试验结果表明,所建立的多重PCR-DHPLC方法操作简便,快速准确,能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因,检测限达0.5ng/μL,可用于番茄中转基因成分的检测。     

黄瓜细菌性角斑病的分子检测

探索黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.)的分子检测技术,为快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。根据丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病型病菌与其他黄瓜病原菌核糖体基因转录间隔区 (16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Spacer,ITS)序列间的差异,设计特异性引物PLf1/PLr2 (PLf1: 5'-ATA AGG GTG AGG TCG GCA GTT-3',PLr2: 5'-CTC GTC TTT CAT CGC CTT TG-3')。引物PLf1/PLr2可从丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病型病菌中增出一条473 bp的条带,将黄瓜细菌性角斑病菌和其他菌种分开。建立的黄瓜细菌性角斑病分子检测的方法可用于该病害的快速分子检测,可直接对黄瓜叶片汁液进行病原菌检测,并且可在接种后病症发生前72 h内检测到病原菌。     

转基因玉米LAMP检测体系的建立及应用

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法.利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索.结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60 min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍.LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景.     

内蒙古地区番茄溃疡病菌PCR快速检测技术及22个番茄品种种子表面带菌检测

为快速检测番茄种子表面的带菌情况,以便及时有效防控番茄溃疡病,从而减少病害损失。试验用细菌基因组DNA试剂盒提取番茄溃疡病的总基因组,用通用引物进行PCR反应。以番茄溃疡病菌的DNA为模板,使用专一性引物进行PCR扩增,通过对专一性引物的筛选,最终确定了Cla F1-Cla F2为快速检测番茄溃疡病菌PCR的特异性引物。该检测方法特异性强、灵敏度高,模拟种子带菌,对浸种水的检测灵敏度达1×105CFU/m L。经PCR快速检测,22个番茄品种中只有黑贝番茄、粉红番茄和保罗塔带有番茄溃疡病菌,其余19个品种均未带菌。该方法直接对种子进行检测,不需进行病原菌分离培养,快速简便。     

一步双重PCR检测香蕉枯萎病菌生理小种

通过设计特异引物PR1/PR2和ST1/ST2分别扩增出香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的DNA特异片段,优化检测体系的反应参数,建立了香蕉枯萎病菌生理小种双重PCR检测方法,检测体系的最佳退火温度为56℃,检测灵敏度的最低起始DNA为200pg。应用结果表明该体系有较高的准确性和稳定性,在1次PCR扩增中引物PR1/PR2和ST1/ST2能同时检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种。     

砀山梨黑斑病分子检测技术研究

黑斑病是砀山梨上最重要的病害之一,建立一套砀山梨黑斑病的分子检测技术对该病害的早期及时防治及口岸检验检疫具有重要的意义。本研究通过分析比较砀山梨黑斑病菌与其他19种不同真菌的ITS序列,设计了1对特异性引物,能够从该病菌中特异性地扩增出1条398 bp的条带,而其他测试真菌中不能扩增出该条带。在灵敏度检测中,该菌的基因组DNA检出限为10 pg/μL,同时在发病的砀山梨果实组织样品和接种梨黑斑病菌的梨果实组织样品中检测出梨黑斑病菌。因此,可以将该对引物用于梨黑斑病早期诊断及病菌的PCR检测,为指导果农及时进行药剂防治提供有效的技术支撑。     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较

用分子标记辅助选择进行精细定位和遗传改良时,首先就需要大批量提取植物DNA,作为PCR反应的模板。水稻基因组DNA常用的简易提取方法有碱处理法和高温水煮法等,本文改进了常规的CTAB方法,提出另一种简便的高质量DNA提取方法,称“简化法”,并比较了这三种方法提取的DNA在数量、质量上的差异,以及作为PCR模板时扩增效果,确定了在精细定位和遗传改良时“简化法”是一种较优的方法。     

山东某猪场繁殖障碍性疾病的诊断研究

采用ELISA、PCR、RT-PCR及细胞培养等方法对山东某猪场流产、死胎及出生后几天死亡的小猪进行猪瘟病毒(CSFV),伪狂犬病毒(PRV),圆环病毒2型(PCV-2),细小病毒(PPV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)五种繁殖障碍性疾病进行检测,并应用ELISA猪瘟抗原检测试剂盒检测猪瘟病毒.检测结果表明,猪瘟病毒与圆环病毒2型为阳性,猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒、伪狂犬病毒均为阴性.根据结果判定该猪场发生猪瘟病毒与圆环病毒2型混合感染的繁殖障碍性疾病,其中以猪瘟感染最为严重.     

啤酒酵母中乙醇脱氢酶基因Ⅰ的扩增与表达

乙醛是导致啤酒风味丧失的物质。当乙醛的含量超过15mg/L时,啤酒就会产生腐烂的青草味,影响口感。为了解决啤酒酵母菌株乙醛产量过高的问题,本研究拟在啤酒酵母中增加乙醇脱氢酶I(alcoholdehydrogenasⅠe,ADHⅠ)的拷贝数及其相应的表达量,使更多乙醛转变成为乙醇,从而达到改善啤酒风味的目的。     

葡萄苦腐病菌的分子检测方法

葡萄苦腐病菌(Greeneria uvicola)是我国检疫性有害生物.本研究根据G.uvicola的ITS基因序列,设计了PCR引物GUA-1和GUA-2以及实时荧光PCR引物GUA-P1和GUA-P2及荧光探针GUA-Probe-117.利用引物GUA-1和GUA-2进行PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄可产生354 bp的特异性片段;实时荧光PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄均出现强荧光信号(△Rn)增加.而葡萄上其他常见真菌样品以及健康的红提葡萄既无特异性扩增也无荧光信号增加.灵敏度测试中,普通PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.05ng/μL以上的样品,实时荧光PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.0005 ng/μL以上的样品.由此确立了G.uvicola的两种稳定可靠、灵敏的分子检测方法.     

小麦Glu-D3和Glu-B3位点LMW-GS基因特异引物设计与PCR扩增

用CTAB法提取小麦基因组DNA，根据GenBank中公布的已知LMW-GS基因序列，设计并合成染色体位点特异PCR引物1～7；利用特殊小麦材料——六倍体普通小麦阿勃二体、1A、1B和1D缺体，四倍体小麦及二倍体的一粒小麦和节节麦的基因组DNA为模版，在优化的PCR体系下进行特异性扩增和引物验证。结果表明：引物3和引物4为小麦谷蛋白Glu-D     

一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法

本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法.该方法只需将少量(4～6 mg)植物叶片、适量(200μL)TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入1个2 mL离心管,在多功能组织细胞研磨器中振动5 min破碎组织后,直接取1μL DNA溶液作为PCR的模板.本方法具有简单快速、操作效率高、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品的基因型检测.     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

一种简易的猪肉和牛肉分子生物学鉴别方法研究

建立了基于微卫星标记鉴别牛、猪肉制品的方法。根据微卫星标记种间特异性特点,从Genebank中筛选出牛微卫星SignⅠ和猪微卫星标记SignⅡ,并依据各个微卫星标记的侧翼序列设计引物。提取牛、猪肉各48个样品中的DNA作为模板,进行PCR扩增,电泳后得到了各自的目的条带379bp和585bp,根据目的条带的出现与否鉴别牛肉和猪肉。该方法进行鉴定灵敏度高,特异性好,而且方法简单,易于操作,结果易于判断。     

湖南岳阳地区柑橘黄龙病PCR检测

为确诊近年在湖南岳阳部分柑橘产区发生的一种使柑橘叶片斑驳、果实变小及全株矮化,甚至枯死的传染性病害,摸清病源来源,采用多聚酶链式反应(PCR)技术对该地区出现的柑橘黄龙病疑似症状植株进行了检测。结果表明,岳阳华容县南山乡、华容胜峰乡、华容西湖乡从福建黄龙病疫区引进的琯溪蜜柚,PCR扩增带谱为563 bp,与阳性对照一致,存在柑橘黄龙病病菌;在岳阳麻糖春风同一果园中以宫本为基砧高接了琯溪蜜柚（福建引进）的植株,PCR扩增带谱为563 bp,与阳性对照一致。未高接换种宫本无扩增带谱,与阴性对照一致,无柑橘黄龙病病菌;由岳阳本地繁殖的苗木椪柑、脐橙、未高接宫本无扩增带谱,与阴性对照一致,无黄龙病危害。通过本研究可知,湖南岳阳地区存在柑橘黄龙病危害,并为首次发现,但病源主要来源福建黄龙病疫区调进的未脱毒琯溪蜜柚植株,目前传播方式主要是高接放种。     

PCR技术在水产养殖动物病原微生物检测中的应用

随着我国水产养殖集约化程度不断提高,虾类、贝类和鱼类养殖业受到病原微生物的严重影响.因此,如何快速准确预测和诊断水产动物疾病,成为当前水产养殖业十分重要而突出的问题.近年来,随着PCR技术的介入,带动了水产养殖动物病原微生物的检测技术快速发展.文章介绍了PCR及其衍生技术(RT-PCR,Real-time PCR,免疫PcR,套式引物PCR,多重PCR)的原理、特点及在水产养殖动物病原微生物检测中的应用,并对水产养殖动物病原微生物诊断技术的发展方向做出了展望.