用Nested-PCR检测广西黄皮与九里香黄龙病病原

摘要：运用nested-PCR技术对广西黄皮和九里香进行柑桔黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）检测,结果表明：从部分黄皮和九里香样品抽提的DNA中,可扩增出一条特异性的400 bp条带,说明广西种植的黄皮和九里香均可感染黄龙病;在柑桔黄龙病疫区,黄皮和九里香黄龙病感染率分别为35.0%和40.0%。     

阿根廷:建议采用无病毒苗木以缓解柑橘黄龙病蔓延

<正>据悉,为控制柑橘重大病害柑橘黄龙病发生蔓延,阿根廷国家农业食品卫生质量行政部(SENASA)提醒种植户,该病害的传播主要是通过苗木繁殖和染病柑橘材料进行,染病柑橘材料可能会严重影响到柑橘产区。黄龙病控制中最大的困难在于该病菌的潜伏期较长,植株在感染后的6个月一般不会表现出症状,有的潜伏期甚至长达两年。阿根     

柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析

为明确柑橘黄龙病菌的遗传多样性,PCR扩增了6个不同地区黄龙病菌的16SrDNA和16S-23S rDNA间隔区(intergenic spacer regions,ISR),分别通过4种内切酶对其进行了限制性片段长度多态性分析,发现不同分离物的16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区各酶切产物的电泳谱带完全一致,未表现多态性。对16S-23SrDNA ISR进行了克隆和测序,经DNAman和NCBI Blast比对分析发现,6个分离物16S-23SrDNAISR序列之间不存在碱基差异,与数据库中柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)同源性高达99.0%～100%。系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus归为一个类群,而后与Ca.L.africanus、Ca.L.americanus和Ca.L.psyllaurous组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群。结果表明,同一种柑橘黄龙病菌不同分离物16S rDNA和16S-23S rDNAISR无分子变异或变异较小,不存在遗传多样性。     

猪圆环病毒II型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5 ng/ml     

猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。     

黑麦重复序列在检测小麦品种中外源染色体的应用

本研究根据RAPD引物OPH20在黑麦中扩增出的特异序列pSc20H.2设计一对PCR引物pSc20ht-23/24,以来源于黑麦的小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr45及感病对照Thatcher为亲本进行PCR扩增。并对42个小麦抗叶锈近等基因系及103个小麦品种材料进行检测。引物pSc20ht23/24在TcLr45中扩增出一条约750bp的条带,而在Thatcher中无扩增条带。对该特异片段回收、克隆测序为734bp。42个小麦抗叶锈近等基因系检测在TcLr26中扩增出与TcLr45相同的条带,而在同样来源于黑麦的小麦抗叶锈近等基因系TcLr25中未扩增出该条带;中国春-Imperial黑麦附加系1R-7R中除5R外均扩增出该条带;13个1B/1R易位系小麦品种也扩增出该条带;90个地方小麦品种中有16个扩增出该条带,6个品种经系谱分析具有黑麦遗传背景,表明该标记可用于检测小麦中含有的除黑麦5R染色体之外的外源染色质。     

马铃薯纺锤块茎类病毒RT-PCR检测及全序列分析

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,经RT-PCR法扩增出全长的cDNA片段,结果从感病组织中扩增出与预期的360 bp大小的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将其克隆到质粒pGEM-T载体上,进行全序列分析.结果表明,与国内外的报道相比较,核苷酸同源率高达98%以上.PCR产物克隆作为RT-PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,为进一步进行抗PSTVd基因工程研究打下了良好基础.     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达

通过农杆菌侵染和原生质体直接转化法把菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯加工品种大西洋中,获得了13株转化后代,经过PCR分析和Southern blot分析,在5株后代中扩增出900bp目标带,说明菜豆几丁质酶基因已整合到马铃薯四倍体基因组中。RT-PCR分析结果表明,其中的3株叶片中有菜豆几丁质酶基因的表达,而且抗病试验进一步证明了该基因在叶片中有较强的表达强度,转基因植株的抗病性比对照提高了30%以上。     

番茄育种种质对南方根结线虫抗性评价及Mi-1基因检测

本研究以自育的26份番茄育种种质和抗南方根结线虫番茄品种‘仙客1号’及感南方根结线虫品种‘阿乃兹’为试验材料,采用病土盘栽自然发病鉴定、苗期二龄幼虫人工接种鉴定和PCR扩增及CAPS检测相结合的方法,研究供试材料对南方根结线虫的抗性水平及基因型。鉴定结果表明,供试的28份番茄材料中,高抗17份、抗病6份(包括抗病对照‘仙客1号’)、感病2份、高感3份(包括感病对照‘阿乃兹’),无免疫材料,且病土盘栽鉴定与苗期接种鉴定的结果一致。PCR扩增结果表明,27份番茄材料均能检测到一条750 bp的特异条带;TaqⅠ酶切结果显示,具有酶切位点的22份试材中有15份含纯合显性Mi-1/Mi-1基因、5份含杂合显性Mi-1/mi-1基因、2份含180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段,并且这22份试材对南方根结线虫表现高抗或抗,而其余5份不含显性Mi-1基因的试材则表现高感或感,证明Mi-1是具有抗南方根结线虫能力的基因,分子检测结果与病土盘栽鉴定和苗期接种鉴定的结果吻合率达92.6%;含有180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段的高抗材料可能含有其它抗根结线虫基因。分子检测与抗性鉴定相结合,能为创制抗南方根结线虫新种质提供一种更加省时、省力且经济有效的科学育种方法,可为番茄抗南方根结线虫育种提供理论依据和实践经验。     

单克隆抗体-胶体金标记技术快速检测柑桔黄龙病

应用单克隆抗体-胶体金标记技术，采用徒手切片法和斑点试验法检测柑桔黄龙病获得成功。该方法检测速度快，操作简单，成本低，适合柑桔种苗大批量检测和田间普查。采用单抗金标技术对田间栽培的柑桔品种、柑桔实生苗、试管微芽嫁接苗、热处理脱毒后的嫁接苗进行检测，结果表明田间栽培的6个柑桔品种不论是否显示黄龙病症状均检测到柑桔黄龙病病菌，而消毒种子播种所得实生苗及试管微芽嫁接苗为无病株，带病株经过30d 40oC恒温热处理后产生的新梢及其嫁接苗绝大部分也是无病株。     

柑橘黄龙病疫情监测与防控技术研究

为了研究柑橘黄龙病传播介体种群消长规律和疫情动态,破解柑橘黄龙病防控问题,以主栽的早熟‘宫川’品种为重点在古城和大田柑橘园设立2个柑橘木虱监测点,采用定点定人定树定枝定时方法对柑橘木虱进行系统监测;以乡镇为单位每年在10-11月的果实显症期对全市柑橘园柑橘黄龙病进行全境式普查。结果表明,柑橘木虱季节性消长规律主要呈三峰型曲线变化,其峰期主要在6月下旬至7月下旬、8月中旬至9月中旬、10月上旬至11月上旬,其年度之间和果园之间总体趋势基本一致,但其峰值峰次差异却较大,主要受初见期、基数和气温等三要素影响所致,并建立柑橘木虱时序成若虫数量与其气温关系模型：D=0.018T+17.365（n=36,r=0.3563*）。针对柑橘木虱传播柑橘黄龙病的特征特性,摸索集成了“一挖两治”防控策略和“三防五关”防控技术。经过3年的全面应用,将柑橘黄龙病发病面积持续控制在5%以内,2008-2010年将加权平均株发病率分别控制在0.084%、0.077%、0.051%,基本达到了持续控制效果,保障了临海市柑橘产业持续健康发展。     

广西黄皮、不同柑桔品种黄龙病检测及16S rDNA序列分析

运用nested-PCR技术对广西黄皮及11个柑桔品种进行柑桔黄龙病（citrus huanglongbing, HLB）检测,结果表明：从黄皮及11个柑桔品种中均可扩增出一条特异性的400 bp条带,说明广西种植的黄皮及11个柑桔品种均可感染HLB。同时对广西HLB病原菌16S rDNA进行扩增测序,同源性分析和聚类分析表明,广西HLB病原菌属于亚洲种,且在亚洲种不同株系中,与中国厦门株系及日本株系遗传距离较近。     

柑橘黄龙病入侵与疫情扩散模型研究

为了提示柑橘黄龙病入侵发病扩散规律,评估防控成效,有效控制疫情,2002—2007年在柑橘黄龙病初发生区采用设立自然条件、治虫防病和综合防控三处理类型,监测柑橘黄龙病发生扩散动态,结合面上疫情普查资料,创建柑橘黄龙病自然条件下、治虫防病条件下以及综合防控条件下的疫情扩散模型,分别为：P₁=12.9690N₁-18.10（n=6,r=0.9945**）或P₁=0.2293N12+11.135N₁-14.89（n=6,r=0.9948**）,P₂=7.8857N₂-10.2667（n=6,r=0.9675**）或P2=1.4107N²₂-1.9893N2+2.90（n=7,r=0.9996**）和P3=-0.1398x N₃²+1.1248N3-1.141(n=6,r=0.8396*),结果表明柑橘黄龙病在自然条件下从发病到毁园需要9a时间,单一治虫防病措施难以达到持续控制效果,只有采取综合防控措施,才能达到可持续控制,保障柑橘优势产业持续健康发展。     

铝胁迫对柑橘实生幼苗生长的影响

每天用含0、0.2、0.6、1.0和1.6 mmol/L AlCl3&#8226;6H2O的1/4 Hoagland营养液浇沙培茶枝柑(Citrus reticulata)、芦柑(C. reticulata)、福橘(C. reticulata)、四川红橘(C. reticulata)、文旦柚(C. grandis)、尤力克柠檬(C. limon)、雪柑(C. sinensis)、酸橙(C. aurantium) (来自湖北)、枸头橙(C. aurantium) (来自浙江)、红木黎檬(C. limonia)、枳壳(Poncirus trifoliata)和枳柚（P. trifoliata × C. grandis）等12个柑橘种类品种实生幼苗3个月。结果表明：雪柑、茶枝柑、芦柑、福橘、四川红橘、尤力克柠檬和枳的耐铝性较强,即使在最高铝（1.6 mmol/L）处理下,其根系、地上部和单株干重均与对照无显著差异;枸头橙、酸橙、红木黎檬和枳柚的耐铝性较差,在最高铝（1.6 mmol/L）处理时,其根系和/或地上部的生长均会受到不同程度的抑制;文旦柚耐铝性最差,最低铝浓度（0.2 mmol/L）处理时,其根系和单株生长量就显著下降。铝胁迫引起茶枝柑、福橘、四川红橘、酸橙和枳实生苗根冠比增加,但对芦柑、枸头橙、尤力克柠檬、红木黎檬、文旦柚和枳柚实生苗根冠比无显著影响;除最低铝处理时雪柑根冠比降低外,其它处理之间无显著差异。     

柑橘黄龙病病原分化及发生规律研究进展

由韧皮部难培养细菌（Candidatus Liberibacter spp.）引起的柑橘黄龙病是一种毁灭性柑橘病害。主要综述了柑橘黄龙病菌的特性及种内分化新进展,病害的潜育期、时空动态及病害循环等田间发生特点,并从寄主植物、传播介体、生存条件等角度对影响病害流行的因素等进行了分析。     

柑橘果实发育成熟中果肉游离糖、 肌肌醇及钾含量的变化

以龟井（无籽）温州蜜柑和鄂柑1号（有籽）橘为试材，对果实发育成熟过程中果肉游离糖（果糖、葡萄糖和蔗糖）、肌肌醇及钾含量变化进行了测定。结果表明：(1)果实增大初期鄂柑1号果肉果糖和葡萄糖含量明显上升，蔗糖变化小，肌肌醇却趋下降，进入果实增大中后期，蔗糖含量显著上升，其它变化小；而龟井的果糖、葡萄糖和蔗糖均于果实增大初期和中期出现明显积累，肌肌醇除在增大中期出现一峰值外趋于平稳；采前果实发育期两品种总糖含量变化趋势均与各自的蔗糖较一致；(2)采后贮藏期内两品种果肉总糖和肌肌醇含量均趋于稳定，而二者的果糖、葡萄糖和蔗糖含量变化趋势却均趋相反；(3)两品种果肉钾含量均在果实增大期内出现明显上升并居相对较高水平。     

南丰蜜橘胚性愈伤组织诱导及其转化研究

摘要∶南丰蜜橘是原产于中国的古老柑橘品种,其果实皮薄而肉甜,深受消费者喜爱,当前南丰蜜橘的品质发生劣变,影响了其商品价值。为采用基因工程育种以改善南丰蜜橘品质,通过诱导其愈伤组织并以其为试材进行了转基因研究。南丰蜜橘自种子实生苗下胚轴处长产生出愈伤组织,挑选胚性愈伤组织进行增殖后,采用根癌农杆菌介导法进行开花相关基因AP1的转化。结果获得22团抗性愈伤组织,平均产出率为7.3团/皿,表明该品种有较高的转化率。抗性愈伤组织经PCR分析、Southern blot检测证实为转化子。本研究结果表明南丰蜜橘胚性愈伤组织是基因工程改良的良好受体,可用于其它基因的转化研究。     

柑桔黄龙病综合防治的理论与实践

柑桔黄龙病是世界性的毁灭性病害，除原有的亚洲、非洲外，美国、巴西也已发现此病和其传播媒介－柑桔木虱。根据柑桔木虱是黄龙病唯一自然传播媒介和广西柑桔主产区无法实施隔离种植的特点以及柑桔黄龙病已成为广西柑桔发展最大障碍的实际和柑桔生产现状，提出在黄龙病区建立以柑桔黄龙病为第一重要病害，柑桔木虱为第一重要害虫的柑桔病虫害综合防治体系，实施以控制柑桔木虱为重点的柑桔黄龙病综合防治措施。3年的大面积田间验证试验结果表明，验证区累计发病率为0.72%，对照Ⅰ区达9.42%，对照Ⅱ区达7.14%。