构建黍稷分子遗传图谱SSR引物的筛选

采用SSR-PCR扩增技术,将实验室利用高通量测序与磁珠富集法结合开发得到的1 210对黍稷SSR引物进行筛选,筛选出在会宁大黄糜、陇糜8号、太原55号和会宁野糜子4个黍稷品种之间表现出条带清晰、多态性明显、重复性较好的引物;并通过提取DNA以及PCR过程中退火温度的简单优化来建立比较适宜的黍稷SSR分子标记反应体系。结果表明,在DNA提取过程中将ddH2O的量减少到100μL,增加65℃的水浴时间并增加4%β-巯基乙醇和DNA浓度等可以获得较高质量的DNA。利用优化好的反应体系从1 210对SSR引物中筛选出116对多态性较好的引物,占总数的9.59%,其中,群体一的2个亲本所特有的引物有36对,群体二的2个亲本中特有的引物有97对,2个群体共有的多态性引物有19对;对引物碱基结构分析发现,选用的1 210对引物中有1 173个双碱基重复SSR和36个三碱基重复SSR;筛选到的多态性引物中双碱基重复SSR有102个。三碱基重复SSR有14个。筛选出的多态性SSR标记能用于黍稷的遗传多样性和群体遗传结构研究。     

玉米杂交种DNA指纹图谱及其在亲子鉴定中的应用

采用79对SSR引物分析了86个玉米杂交种的72份亲本自交系的遗传多态性,从中筛选出扩增带型清晰、稳定的50对引物用于构建86个杂交种的DNA指纹图谱数据库;进而确定10对核心引物和判别标准用于亲子鉴定研究。结合玉米SSR分子标记检测技术和单籽粒DNA快速提取方法,DNA指纹数据库和判别标准可有效地用于玉米杂交种的亲子鉴定。     

花生栽培种SSR遗传图谱的构建

花生栽培种品种间分子多态性相对缺乏, 至今未构建出较完整的分子遗传图谱。本研究以粤油13和阜95-5为亲本, 通过杂交构建包含184个F6重组自交系的遗传作图群体。采用652对genomic-SSR引物和392对EST-SSR引物对亲本进行多态性检测, 从中筛选出121对多态性引物, 在亲本中共检测到123个多态性位点。利用作图群体对多态性SSR位点进行遗传连锁分析, 获得包含108个SSR标记(102个genomic-SSR标记和6个EST-SSR标记), 涉及20个连锁群, 总长568 cM, 平均图距为6.45 cM的花生栽培种遗传图谱。与前人构建的花生野生种(A. duranensis × A. stenosperma, AA genome)SSR遗传图谱比较, 初步确定本研究构建的遗传图谱中有11个连锁群与野生种遗传图谱的6个连锁群存在同源关系。     

遗传群体构建的分子标记检测体系

为了建立遗传群体构建的分子标记检测体系，利用SSR分子标记技术构建了从DNA提取、引物多态性筛选、亲本和子代植株的PCR扩增、扩增产物的电泳检测等4 步检测体系，实验中仅用1 对位于大麦7H染色体上的引物HvWaxy4 就对7 个F1子代植株进行了鉴定，通过鉴定判断出其中3 个植株为F1子代，4 个单株为自花授粉产生的子代。表明SSR标记技术在验证遗传群体构建过程中F1杂交植株真伪的可行性，该方法适用于自花授粉作物的遗传群体构建过程中F1植株的真伪检测。     

基于白木香转录组的SSR序列特征分析

为探究白木香的简单重复序列特征,开发SSR分子标记用于白木香种质资源的遗传分化和分子鉴定,本研究鉴定了白木香转录组unigene序列的SSR位点,对其SSR的分布及序列特征进行统计分析,进而设计SSR引物,并验证其SSR引物的多态性。结果表明,在128 712条unigene中共鉴定到9 362个SSR位点,分布频率为7.27%。SSR序列中双碱基重复序列最多,占总SSR的54.90%;白木香双碱基重复序列以AG/CT、AC/GT为主,占34.22%。SSR位点重复次数主要集中在5～11次,占总SSR位点数的96.56%,其中三碱基重复5次的SSR位点数最多,共有1 925个。设计并合成50对引物,其中35对引物可扩增出预期大小条带,扩增效率达到70%。以24个不同白木香个体对35对引物进行扩增,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR引物多态性,表明SSR引物具有多态性。研究表明,白木香转录组SSR重复基元类型丰富,分布密度高,多态性高,可用于白木香资源的遗传多样性评价、遗传分化、种质鉴定和分子育种等后续研究。     

SSR标记检验玉米杂交种子纯度核心引物的构建

利用50对SSR引物对收集到的18个玉米杂交种及其亲本进行SSR标记分析,以期筛选一套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心SSR引物。试验结果表明,50对SSR引物在18个杂交种及其亲本中,有20对引物扩增出多态性特异条带,进一步对20对引物进行重复试验和PCR反应条件的优化,筛选出了8对SSR标记引物,分别在18个玉米杂交种及其亲本中扩增到了条带清晰、多态性好的条带,可用于其玉米杂交种子纯度鉴定和检验。这为玉米杂交种种子真实性和纯度检验、解决玉米种子质量纠纷提供了更为准确可靠的参考依据。     

利用SSR荧光标记构建20个高粱品种指纹图谱

为建立高粱种子纯度及真实性鉴定技术体系,构建高粱栽培品种DNA指纹图谱数据库是必要的。利用SSR荧光标记技术筛选出36对SSR荧光标记引物,构建我国高粱杂种优势利用以来中晚熟区主推的20个品种的SSR指纹图谱。36对SSR引物共扩增出235个等位基因,平均每个等位基因检测到多态性位点7个,多态性位点变化范围为2~12个。20个高粱品种36个SSR位点的遗传多样性指数和多态性信息量的变化范围分别为0.3490~0.8813和0.3144~0.8696,平均值分别为0.6976和0.6571。从36对SSR引物中筛选到多态性丰富的2对引物作为高粱品种鉴定的特征引物,2对SSR特征引物组合可区分所有供试品种。20个高粱品种的SSR指纹图谱互不相同,可以作为各品种特定的图谱,为品种鉴别提供依据。     

玉米分子遗传框架图谱构建

以48-2×5003的166个F2单株为作图群体,利用135个RFLP探针和131对SSR引物对亲本48-2、5003之间的多态性进行了检测,筛选出109个RFLP多态性探针和81对SSR多态性引物用于F2群体分析,利用上述109个RFLP标记和81个SSR标记,构建了具190个RFLP、SSR标记199个标记位点的玉米分子遗传图谱,覆盖整个基因组2984.1 cM,标记间平均间     

利用RAPD和SSR分析36个贵州主要玉米种质的比较研究

利用RAPD和SSR两种标记方法研究了36个玉米自交系的遗传多样性,并对这两种分子标记系统进行了比较.利用筛选出的22条RAPD引物,检测到了148条有多态性的带;利用筛选出的34对SSR引物,检测到158个等位基因.RAPD和SSR分子标记均有很高的多态性,RAPD多态性带比例为95.95%,SSR位点检测出的平均等位基因数位4.65.RAPD分子标记结果将36个玉米自交系划分为6大类,SSR分子标记将其划分为5大类.与系谱分析基本一致,两种分子标记划分的结果也相似.研究认为,RAPD、SSR两种分子标记系统均适合于玉米种质的遗传多样性研究,但SSR更可取.     

烤烟品种‘Oxford207’青枯病抗性的遗传分析与分子标记初选

为了研究烟草青枯病抗性的遗传特性和开发抗性相关分子标记,以抗青枯病的烟草品种‘Oxford207’,感病品种‘红花大金元’为亲本,构建了F1、F2和BC1群体,并采用苗期恒温水培接种法鉴定了群体青枯病的抗性。结果表明,接种后定期调查的F1、F2和BC1F1的死亡率比较接近,均稳定介于抗病亲本和感病亲本之间。F1、F2和BC1F1死亡率曲线下面积比较接近,同样介于抗病与感病亲本之间。表明‘Oxford207’的青枯病抗性不符合典型的显性或隐性基因控制模型,属于加性基因控制。采用简单重复序列(SSR)和分离群体分组分析法初步筛选了抗性相关的分子标记。从800多条SSR引物中,筛选出263个在抗感亲本间有多态性且在F1中呈共显性的引物、3个在抗感池之间有多态性的引物。     

基于SSR标记的制干辣椒品种资源遗传多样性分析

本研究采用SSR分子标记方法,分析了36份制干辣椒品种资源间的遗传关系。从36对SSR标记中筛选出12对进行电泳分析,这12对引物扩增条带清晰且多态性丰富。分析结果表明:12对SSR引物共获得87条谱带,平均每对引物7.3条谱带,多态性位点58个,平均多态性比率66.67%;供试材料间的遗传相似系数介于0.277 8~0.805 6之间;遗传相似系数以0.76为阀值时,可将36个制干辣椒品种分为3大类群;进一步的群体结构分析表明3个类群间种质资源相互渗入情况非常明显,这可能是由于受到强烈的人工选择的影响。     

与黄瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记

以黄瓜抗枯萎病亲本WIS2757和感枯萎病亲本津研2号及其F2分离群体为试材,采用分离群体分组分析法(BSA)进行了与黄瓜抗枯萎病基因连锁的分子标记研究。运用RAPD技术,利用780条RAPD引物对抗、感亲本进行筛选,其中有113条引物在两亲本之间表现多态性,但仅有引物S49在两组间多态性标记与亲本的多态性标记相同。经F2单株分析,引物S49扩增出的特异DNA片段与WIS2757抗黄瓜枯萎病基因连锁,遗传距离为14 cM。DNA标记条带大约为300 bp,定名为S49-300。     

与甜瓜嫁接亲和性连锁分子标记鉴定

使用与南瓜类型砧木(“壮士”)嫁接亲和性差异明显的两个甜瓜自交系(85-1和B717)为亲本,配制F2∶3家系群体;利用BSA法构建亲和性优差池,结合PCR技术筛选与嫁接亲和性有关的分子标记.结果表明:使用葫芦科遗传连锁图谱上发表的750对SSR、SRAP和AFLP等分子标记引物扩增,最终筛选出在两个甜瓜材料之间具有多态性的382对引物,其中9对引物分别在嫁接亲和性优差DNA池中扩增出差异性片段.将这些标记用于F2群体的扩增,计算标记与嫁接亲和性遗传连锁距离,两对SSR引物CMN-0616和M103与嫁接亲和性的遗传距离分别为17.6 cm和9.3 cm.这2对引物有望成为鉴定甜瓜嫁接亲和性的辅助引物,从而将嫁接亲和性差异材料从分子角度区别开来,为甜瓜嫁接接穗育种等研究提供参考.     

采用基于高分辨率熔解曲线技术的SNP标记定位徐州142无絮的短绒控制基因

【目的】定位徐州142无絮(XZ142w)突变体的短绒控制基因n2。【方法】以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)徐州142(XZ142)×XZ142w的F2群体为研究对象,利用108个简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记对n2进行初步定位,再根据2个亲本材料中有单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphic,SNP)的差异基因设计50对SNP引物,用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术从中筛选在亲本间有多态性的SNP引物,并用于后代的基因分型。【结果】利用108个SSR标记将n2初步定位在26号染色体的20.2c M的遗传区间内;用HRM技术筛选到9对亲本间有多态性的SNP引物,成功实现基因分型;并结合以SSR构建的连锁图谱,将n2的遗传区间缩小为19.5 c M,n2与最近的SNP标记Cricaas20158遗传距离为5.5 c M,且遗传图谱上的标记与四倍体陆地棉测序物理图谱基本一致。【结论】HRM技术可用于棉花中的SNP检测和n2基因的定位。     

SSR标记对甜瓜杂交种‘众天翠雪’纯度的鉴定

旨在筛选能够用于甜瓜杂交种纯度和真实性鉴定的SSR引物。利用公认的18对多态性较好的甜瓜SSR(Simple Sequence Repeats)引物对甜瓜杂交种"众天翠雪"及其亲本进行多态性筛选,并在杂交群体中进行验证。13对引物在亲本间具有多态性条带,经过多次重复,筛选到2对引物在亲本间具有多态性、子代中兼具双亲条带,并且在子代群体中检测结果与田间形态鉴定结果一致。引物RF151和RF144能够作为‘众天翠雪’杂交种纯度鉴定的特异引物进行纯度检测。作为共显性标记特性的SSR分子标记可以作为杂交种纯度鉴定的重要工具。     

基于转录组测序数据的甘薯SSR标记开发及群体聚类分析

利用转录组数据开发SSR标记,是目前较为经济高效的DNA分子标记开发方法。为了开发更多适用于甘薯的SSR标记,本研究在前期对甘薯体细胞杂种KT1及其两个亲本4个干旱胁迫处理的24个样本转录组de novo测序的基础上,对获得的105 959条Unigene中大于等于1 000 bp的FASTA序列进行搜索,共找到12 105个SSR位点。从中筛选设计了200对SSR引物在KT1及其亲本中筛选验证,最终选择了20对多态性较好的引物,对来自不同地区的94份甘薯种质资源进行了群体聚类分析。聚类分析把94份实验材料分为3个亚群,较清晰地区分了不同材料之间的遗传相似性。这些基于甘薯转录组测序开发的SSR标记为甘薯的遗传多样性分析、辅助育种和遗传图谱构建等研究的开展提供了更加丰富的候选标记。     

草棉EST-SSRs的遗传评价

根据GenBank中公布的247条草棉EST序列,搜索SSR并进行引物设计。其中的25条序列含有27个SSR,1~6碱基重复类型都存在,二碱基和三碱基重复的频率较高。为了明确在A、D和AD基因组中的可转移性,依据25条序列共设计25对EST-SSR引物,其中22对引物扩增出清晰可辨的DNA条带,产生92个多态性片段,平均每对引物产生3.64个多态性片段。引物的多态性信息含量(PIC)在0.49~0.91之间,平均为0.81。6对引物在BC₁种间作图群体[(鄂棉22 × Pima3-79) ×鄂棉22]中表现多态性,产生7个多态性位点,其中5个为共显性,2个为显性。除HAU230b标记在BC₁分离群体中不符合孟德尔式分离比例,其余引物表现正常分离。6个位点被整合到陆地棉和海岛棉种间BC₁遗传连锁图谱上的6条染色体：有4个位于A亚基因组的4条染色体上(Chr.6、10、11和12),2个位于D亚基因组的2条染色体(Chr.19和20)。     

36个马铃薯品种的SSR分析

为明确36个马铃薯品种在DNA分子水平上的遗传差异,利用SSR分子标记技术对其多态性进行了分析。试验从90对SSR引物中筛选出适宜于36个马铃薯品种基因组DNA扩增的引物10对,PCR扩增获得301个SSR条带,多态性条带百分率为71.1%。引物STACCA3和SSR111扩增的SSR指纹图谱差异明显,可作为36个马铃薯品种间鉴别的分子依据。36个马铃薯品种间的遗传距离(GD)变幅为0.33～0.85,平均为0.54,其中,大于GD平均值的品种有20个,占供试品种的55.56%。以GD值0.57为基准,将36个马铃薯品种划分成7类,从DNA分子水平揭示出各供试品种间的亲缘关系。     

基于转录组测序的槜李EST-SSR标记开发

为开发槜李EST-SSR标记,本研究利用MISA软件筛选了槜李花转录组测序获得的35584条Unigenes,对其SSR信息进行分析后,利用Primer Premier 3.0软件设计EST-SSR引物,并随机选取40对SSR引物对12个李品种进行EST-SSR引物筛选及多态性分析。结果发现,在槜李花转录组中共搜索到个10791个SSR位点,分布于8433条Unigenes,SSR发生频率为23.70%,平均每3.71 kb含有1个SSR;SSR重复基元中二核苷酸重复出现频率最高,占总SSR数量的52.98%,其次为三核苷酸重复(占24.00%)和单核苷酸重复(占20.95%);二核苷酸重复基元以AG/CT为主(85.95%),三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主(31.24%)。利用Primer Premier 3.0软件共设计出9870对候选引物,随机选择40对引物对12个李品种进行SSR引物筛选及多态性分析。40对引物均能扩增出预期大小的条带,有效扩增效率为100%,40对引物中有5对引物在12个李品种中表现出多态性。本研究开发的EST-SSR标记可为李属植物遗传多样性分析提供丰富的候选标记,同时可为槜李发育相关功能基因定位、遗传图谱构建、及分子标记辅助育种等研究提供帮助。     

西红花转录组SSR信息分析及其多态性研究

为开发西红花转录组SSR标记,利用MISA软件筛选了西红花球茎转录组测序获得的29 572条Unigenes,对其SSR信息进行分析;利用Primer 3.0软件设计SSR引物,并随机选取30对SSR引物对6个西红花品种进行SSR引物筛选及多态性分析。结果发现,在西红花转录组中共搜索到个7 804个SSR位点,分布于6 306条Unigenes,SSR发生频率为18.73%,平均每5.85 kb含有1个SSR;SSR重复基元中单核苷酸重复出现频率最高,占总SSR的47.83%,其次为三核苷酸(32.94%)和二核苷酸重复(17.41%);二核苷酸重复基元以AG/CT为主(86.68%),三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主(24.43%)。利用Primer 3.0软件共设计出11 508对候选引物,随机选择30对引物对6个西红花品种进行SSR引物筛选及多态性分析。30对引物均能扩增出预期大小的条带,有效扩增效率为100%,30对引物在6份西红花品种间未表现出多态性。本研究开发的SSR标记可为西红花遗传图谱构建、抗病虫及抗逆功能基因定位、分子标记辅助育种及西红花遗传多样性分析等提供丰富的候选标记。