适用于4种玉米基因型的农杆菌转化方法的探讨

利用改良的农杆菌培养液、侵染液、共培养培养基和筛选培养基等技术体系,对4个玉米基因型Hi-Ⅱ、H99、国内2个优良自交系R18-599和齐319的新鲜幼胚、预培养幼胚、胚性愈伤组织进行了农杆菌转化研究,并比较了不同共培养方式对农杆菌侵染不同玉米组织的影响。结果表明,Hi-Ⅱ新鲜幼胚在固体培养基上共培养和滤纸上共培养后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和4.4%,前法优于后法;Hi-Ⅱ新鲜幼胚、预培养3 d的幼胚愈伤组织经农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和12.1%,新鲜幼胚比预培养的幼胚愈伤组织更适合于农杆菌转化。用上述优化的条件对另外3个不同基因型的2种不同外植体H99、齐319(新鲜幼胚)和R18-599（胚性愈伤组织）进行遗传转化,共培养3 d后的GUS基因瞬间表达率分别为65.2%、52.6%和58%,表明该转化体系适合于上述4种基因型的幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化。此外农杆菌侵染Hi-Ⅱ新鲜幼胚后经在含巴龙霉素25~100 mg L^-1培养基上3轮选择后,抗性愈伤组织获得率为2.4%,近似反映了本研究的遗传转化率。其他3个基因型的抗性愈伤也正在筛选中。结果初步表明,本研究建立的农杆菌介导的玉米遗传转化体系可能对4种基因型均适用。     

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

影响农杆菌介导旱稻转化效率主要因素的研究

针对旱稻在基因工程中转化效率低这一难题,以4个旱稻品种为对象,对农杆菌介导的遗传转化的各个步骤进行了优化试验,结果表明NB(N6 macro elements;B5 micro elements and vitamins;proline 500 mg L^-1,L-Glutamine 500 mg L^-1,casamino acid 300 mg L^-1,sucrose 30 g L^-1,2,4- D 2 mg L^-1,agar 8 g L^-1,pH 5.8)培养基适合于旱稻愈伤组织诱导;AAM-AS (Na₂HPO₄·2H₂O 339.2 mg L^-1; KCl 2.95 g L^-1; MgSO₄·7H₂O 500 mg L^-1; CaCl₂ 114.4 mg L^-1; MnSO4·4H₂O 10 mg L^-1; H₃BO₃ 3 mg L^-1; ZnSO₄·7H₂O 2 mg L^-1; KI 0.75 mg L^-1; NaMO₄ 0.25 mg L^-1;CuSO₄·5H₂O 0.0387 mg L^-1;CoCl₂·6H₂O 0.025 mg L^-1; VB1 0.5 mg L-1;VB6 0.5 mg L^-1;烟酸0.5 mg L^-1;肌醇100 mg L^-1; 甘氨酸7.5 mg L^-1;精氨酸174 mg L^-1;谷氨酰铵876 mg L^-1; casamino acid 500 mg L^-1; 蔗糖68.5 g L^-1; 葡萄糖35 g L^-1; AS 200 µmol L^-1 pH 5.2)是农杆菌的最佳重悬液;对NPT(new plant type, NPT)这种侵染后易水渍化品种, 滤纸法共培养可将其抗性愈伤发生率提高15倍以上;筛选及分化前对抗性愈伤组织进行2 d的干燥培养可显著加快愈伤组织分化进程;在分化培养基中加入AgNO₃有助于提高分化率;而短期高浓度的CuSO₄处理可显著提高分化率。利用此体系获得了一大批PCR鉴定阳性的转基因株; Southern blot检测证明外源基因大多数以单拷贝形式整合在转基因植株中。     

新疆棉花4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生

以新疆4个主栽棉花品种新陆中20、新陆早24、新陆早33和03298为材料, 通过不同浓度的激素组合成功地诱导获得了体细胞胚并进一步发育成苗。研究发现, 所用的4种激素组合均能有效诱导愈伤组织, 其中又以0.02 mg L^-1或0.10 mg L^-1 KT和0.1 mg L^-1 2,4-D组合的诱导效果最佳; 两个诱导措施有利于胚性愈伤组织的产生, 即沿中柱纵切棉花下胚轴切段, 并以纵切面接触培养基; 愈伤组织诱导培养基中KNO₃用量加倍。挑选黄绿色、灰绿色或浅绿色的质地疏松的愈伤组织继代于无激素且KNO₃含量加倍的培养基中可产生胚性愈伤组织, 并在高比例KT/2, 4-D(0.05 mg L^-1或0.10 mg L^-1 KT和0.01 mg L^-1 2,4-D)促进下发育成胚。借助在培养基上垫滤纸产生干燥作用, 并间隔使用强透气效果的棉塞对培养三角瓶进行透气处理, 体细胞胚可成熟发育并产生根系发达的正常再生植株。应用此法, 4个实验材料在6~8个月内即可获得大量再生苗。     

转根癌农杆菌介导的AtNHX1基因马铃薯的获得

构建重组表达质粒pBI12135-GZ+AtNHX1（带有CaMV 35S启动子）,通过农杆菌将其携带的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX）转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”试管薯薄片和“克新2号”茎段。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用50 mg L^-1卡那霉素 +300 mg L^-1头孢霉素筛选抗性芽,试管薯薄片获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37%;茎段未获得抗性植株。抗性植株的总DNA用AtNHX1基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90%。Southern杂交结果证实,外源基因多以双拷贝整合到马铃薯的基因组中。Northern杂交结果表明,转基因植株可以进行AtNHX1基因mRNA的正常转录,但植株间存在着转录量的差异。该研究为耐盐马铃薯的培育奠定了良好的基础。     

农杆菌转化小麦幼胚获得转bar基因再生植株

用农杆菌转化小麦授粉10d后的幼胚，经5‰PPT筛选获得大量正常再生植株。PCR及PCR－Southern杂交检测证明其中23％（18株）再生苗为转化bar基因植株，这些植株可明显提高对basta的抗性。还总结了农杆菌转化小麦幼胚高效获得转基因再生植株的处理程序。     

提高水稻同源四倍体花药培养愈伤诱导率的研究

以同源四倍体水稻原种零轮、02428、培矮64、轮回422及其成对二倍体为实验材料,分别以琼脂浓度（0.5%、0.75%和1%）、碳源种类（蔗糖和麦芽糖）与用量（60 g L^-1和80 g L^-1）、不同激动素（KT和Zip）以及不同基本诱导培养基（MS、N6、M8、NB）等因素为变量,共设计26种诱导培养基（2种对照）,进行了花药愈伤诱导实验,旨在筛选出愈伤诱导率的培养基优化组合。结果表明,琼脂浓度0.75%和60 g L^-1蔗糖组合对提高水稻花药诱导率作用较好, N6培养基及其衍生NB培养基对提高四倍体水稻特别是粳稻花药诱导率有着较好作用。激动素的加入,能显著提高愈伤诱导率,最高可达到84%。在供试的26种培养基中,有6种诱导培养基得到较高的四倍体粳稻愈伤诱导率,有2种诱导培养基得到较高的四倍体籼稻愈伤诱导率,在8种较好的诱导培养基中有3种不但有较高的愈伤诱导率而且具有较高的绿苗率。     

转SbPIP1基因小麦植株的获得及发芽期耐盐性鉴定

为了培育耐盐小麦新材料,利用基因枪转化法将海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)水通道蛋白(plasma membrane intrinsicprotein,SbPIP1)基因导入到小麦品种宁麦13和扬麦158中。对两个品种的各2500枚幼胚进行轰击,分别获得抗Basta再生植株237株和108株(筛选标记基因为Bar基因),经PCR鉴定阳性转基因植株分别为30株和7株。用130mg/L Basta除草剂对T1代幼苗进行喷施鉴定,发现T1代幼苗的Basta抗性出现了分离。遗传分析发现76.19%的株系表现为1对基因遗传的3:1分离,为单拷贝的基因导入。发芽期耐盐性分析发现81.22%的转基因株系的盐害指数低于受体宁麦13的盐害指数,耐盐性强于受体宁麦13。这些转基因材料将进一步用于小麦的耐盐分子育种研究。     

N6培养基添加钙和烯效唑对玉米幼胚培养的作用

通过浓度筛选和比较试验,将以N6培养基为基础的诱导培养基和继代培养基的钙浓度,从1.13 mmol/L提高到5 mmol/L,并分别添加1.00 mg/L和0.50 mg/L 烯效唑（S-3307）,对玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导和继代具有促进作用,而不影响胚性愈伤组织的分化再生。在分化培养基中添加低浓度（0.25 mg/L）S-3307,能显著提高分化再生率     

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化

利用C58c1农杆菌菌株（其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ 基因和GUS基因）为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS基因瞬时表达率达到了15.0% ~ 30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10-25mg/L G418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、X-Gluc染色检测和Southerm blot检测,最终从新春9号和PM97034的农秆菌转化效率高于Bobwhite. Southerm blot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T₁代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经X²。适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3：1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农秆菌敏感和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。     

玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究

以玉米自交系CML295、CML304和18-599R的成熟胚为外植体, 结合幼胚离体培养方法, 探讨并优化了成熟胚来源的胚性愈伤组织诱导及继代培养方法。对其愈伤组织的形态和组织切片的研究结果显示, 继代过程可产生良好的Ⅱ型胚性愈伤组织。在分化培养中分别获得68.6%、75.4%和84.8%的高频再生率, 每愈伤组织块成苗数分别为2.45、2.43和2.75。利用基因枪法转化pCAMBIA1301质粒后的GUS瞬时表达效率分别为57.9%、62.5%和73.1%, 转化pCAMBIA1303质粒后检测GFP的瞬时表达效率分别为23.3%、40%和45.5%。以上3种基因型成熟胚来源的愈伤组织转化率与其对应的幼胚来源的胚性愈伤组织转化率相似。这一技术体系为玉米的遗传改良和功能基因组研究提供了重要的技术平台。     

农杆菌介导玉米愈伤遗传转化研究

以玉米自交系R18-599和齐319幼胚诱导的胚性愈伤为转化受体,对农杆菌浸染并共培养3 d后对GUS基因的瞬时表达率进行检测,优化遗传转化体系。结果表明:愈伤组织的生长状态对转化效率有很大影响,以愈伤组织继代两次、预培养7 d左右为浸染的最佳时期;另外,EHA105菌株对玉米自交系齐319愈伤的浸染效果要好于对R18-599,其平均GUS瞬时表达率分别为31.20%和23.74%,经t测验达显著水平(t<0.05)。     

玉米幼胚培养能力性状QTL分析

以18-599（红）和R15组配的F₂群体,构建了含88对SSR标记的玉米遗传连锁图谱,覆盖基因组1 636.6 cM,标记间平均距离为18.6 cM。结合幼胚组织培养试验将幼胚发生胚性愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织绿苗再分化数作为反映玉米培养过程中胚性愈伤组织诱导力和胚性愈伤组织绿苗再分化力的性状指标,以此调查玉米幼胚培养能力。利用复合区间作图法进行QTL分析,共检测到5个与胚性愈伤组织诱导率有关的QTL,位于第1、3、7和8染色体上,可解释5.25%～23.4%的表型变异;检测到1个与胚性愈伤组织绿苗发生数有关的QTL,位于第3染色体上,可解释表型变异率为13.42%。     

优良玉米自交系丹598和丹988幼胚愈伤组织的诱导和再生

采用玉米自交系丹598和丹988的幼胚作为外植体,以N6和MB培养基为基本培养基,探讨基因型、培养基种类、激素种类和浓度对愈伤组织诱导率的影响,分析不同基因型愈伤组织生长旺盛时期的异同.结果显示:基因型对愈伤组织诱导率高低影响显著,且基因型和培养基之间存在相互作用.2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导形成是必需的,浓度为2.0mg/L时大多能诱导出胚性愈伤组织.本试验建立了玉米自交系丹598和丹988的优良再生体系,为以后的基因转化工作打下了良好基础.     

AgNO_3在小麦幼胚组织培养中的应用研究

为了提高小麦幼胚体细胞再生频率,以河南省大面积推广的豫麦49号、豫麦18号和兰考906为研究对象,研究了不同浓度AgNO_3对小麦幼胚胚性愈伤组织培养特性和草酸盐氧化酶活性的影响.结果表明:基因型间、不同AgNO_3浓度间小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率、愈伤组织绿点率和草酸盐氧化酶活性差异均达到0.01显著水平,基因型间以豫麦18最高、兰考906最低;不同AgNO_3浓度间以MS培养基上附加2.5～5.0 mg/L处理较高.不同浓度AgNO_3条件下小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与草酸盐氧化酶活性相关系数为0.920,达0.01显著水平.可见,在小麦幼胚组织培养过程中可以加入Ag~+提高再生频率.     

玉米自交系愈伤组织的诱导、RAPD分析及扫描电镜观察

以玉米不同自交系的幼胚为材料,用诱导培养基进行培养,以获得愈伤组织.结果发现所有自交系幼胚均可诱导出白色或黄白色的愈伤组织,但其再生能力差异显著,这主要取决于基因型和培养基种类.自交系7922、340幼胚的再生频率高达85.5%和78%.植株再生途径也有所不同,8902、Mo17、4112和846以器官发生途径为主,340、7922、921、853和     

非选择性除草剂Basta对荞麦和莜麦种子萌发的影响

应用植物组织培养技术 ,研究了不同浓度的除草剂Basta对单子叶植物莜麦和双子叶植物荞麦种子萌发和生长的作用 ;应用高温高压灭菌法和过滤灭菌法对Basta进行了处理 ,比较了二者之间的灭菌效果。结果表明 ,当培养基中Basta的浓度超过 4mg·L- 1时 ,可有效杀灭荞麦的种苗 ,而对莜麦种苗的有效作用浓度为 6mg·L- 1以上。高温高压灭菌不会造成Basta的分解和杀灭效果的减弱。