高品质转野生荠菜凝集素基因棉花的获得

利用花粉管通道转基因技术,将DE35S启动子驱动的野生荠菜凝集素(WSA)基因导入10个高品质棉花品种(系)。所使用的转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)和Ω序列,以利于转基因植株的筛选以及WSA基因的高效表达。对转化当代3197棵棉苗的检测结果表明,4.88%植株具有卡那霉素抗性(Kan )。根据野生荠菜凝集素基因序列设计一对特异性引物,对156个Kan 植株进行PCR检测,筛选出45个转WSA基因棉花工程植株。45个株系纤维品质测定结果表明,获得了9个高品质转WSA基因棉花株系。并对植物基因工程研究中以NPTⅡ作为标记基因的局限性以及一些转WSA基因棉花株系纤维强度变劣的原因进行了探讨。     

利用农杆菌介导法转化泗棉3号的研究

泗棉3号农艺性状优良,是20世纪90年代长江流域棉区的主栽品种,利用基因工程导入外源基因进行直接改良,可以迅速获得新的品种或育种材料。以陆地棉泗棉3号的下胚轴为外植体,建立了高效的转化体系,得到了大量的转基因植株。泗棉3号的出愈率和分化率显著高于模式品种Coker 312,同时它出现分化中心的主要形态不同于Coker 312,其胚性愈伤组织主要来源于两类初生愈伤组织。对泗棉3号的胚性愈伤组织进行GUS检测,以及对再生植株叶片进行PCR检测后,阳性植株嫁接于温室。在温室用2 063.98 μmol L^-1的卡那霉素点涂叶片检测nptⅡ基因的表达和取叶片进行gus基因的组织化学检测,同时通过Southern blot分析检测,证明目的基因成功地整合到泗棉3号基因组中。     

转晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)基因棉花及抗旱性分析

本研究将紫杆柽柳(Tamarix and rossowii Litv)晚期胚胎发生丰富蛋白(LEADQ663481)基因导入新疆早熟棉新陆早18号,通过冬季海南加代、夏季新疆继代的方法获得T3代转基因棉花株系。从40株大田卡那霉素检测阳性植株中,经过PCR筛选证明3株为阳性的转化株。在室内条件下,对转化株幼苗进行水培实验,并用12%(w/v)PEG-6000处理12h模拟干旱胁迫。结果显示,干旱胁迫之后,转LEA基因棉花基因表达量显著增加;丙二醛生成量显著降低;游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的生成量显著增加;棉花表型分析也证明了转LEA基因棉花抗旱性有提高。培养45d后,转LEA基因棉花的生物量高于非转基因棉花。本研究结果表明,在干旱胁迫条件下,转LEA基因棉花表现出了优良的生长和生理优势,显示出转LEA基因棉花能提高棉花的抗旱能力。     

转AhCMO基因棉花苗期对干旱胁迫的生理反应

以转AhCMO基因的2个棉花品系L1和L2及其转化受体泗棉3号(SM3)为材料,研究了转AhCMO基因棉花对干旱胁迫的生理反应。试验采用盆栽方式在日光温室中进行,以维持土壤含水量为最大持水量的45%作为干旱处理,以正常供水维持土壤含水量为最大持水量的75%作为对照。结果表明,正常供水条件下转基因品系L1和L2与SM3生长表现一致。但是干旱胁迫下,转基因品系L1和L2的干物质积累量、平均净光合速率以及叶片叶绿素的含量都显著高于SM3;而且L1和L2叶片中甜菜碱含量显著高于SM3,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性也较SM3显著提高。说明2个转AhCMO基因品系的耐旱性得到明显提高,耐旱性的提高与甜菜碱积累量的增加、POD和SOD活性的增强有关。     

转兔角蛋白基因改良棉纤维品质研究

通过花粉管通道转基因技术,将E6启动子驱动的兔角蛋白基因导入高产棉花品种苏棉16号。所用转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)及Gus报告基因。对转化体后代的检测结果表明,T1代有2.1%呈现Gus阳性,在Gus阳性株中84.6%具有卡那霉素抗性。用依据E6启动子序列和兔角蛋白基因序列设计的两对引物,对经过上述筛选的植株进行PCR检测,多次重复,最终确定3株结果稳定的转兔角蛋白基因棉株。从品质分析结果看,这3个株系成熟棉纤维的品质部分得到改良,尤其比强度有较大幅度提高,与转基因受体相比平均提高6.3cN·tex 1。     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

农杆菌介导加幼苗直接形成将Bt-cry1A(b)基因转入印度棉花

利用农杆菌介导法用Bt-cry1A(b)基因对印度栽培棉种进行非基因依赖型遗传转化和植株再生.将印度栽培棉品种Anjali(LRK-516)和LRA-5166与携带Bt-cry1A(b)+nptⅡ基因的根癌农杆菌LBA4404共培养,在含100tμg@ml-1卡那霉素的筛选培养基上获得了可能的转基因直接再生苗.细菌浓度、共培养时间、感染组织的阶段和大小、标记筛选浓度、培养基成分和激素等都影响转化效果和效率.对程序进行了优化.经PCR、Southern杂交、ELISA等方法分别检测,证实了Bt-cry基因的插入和表达.Southern分析表明转化植株存在3～5个基因拷贝,但CRY蛋白表达量非常低(为叶蛋白的0.003%～0.004%)且生化抗虫性很弱或基本不影响鳞翅目昆虫.尽管如此,该方案仍适用于其它CRY基因或重要经济型基因进行非基因依赖型遗传转化和再生,产生转基因棉花.     

棉花转基因材料的获得及主要农艺性状变异分析

 利用不同棉花受体材料进行花粉管通道法遗传转化研究。通过卡那霉素鉴定、抗虫性鉴定和PCR分子生物学鉴定,证明已成功将Bt基因转化到泗棉3号、辽棉15、中棉所19、中棉所29母本、中棉所35、中棉所36等棉花材料中。通过对转基因材料后代与非转基因材料的铃重、衣分和纤维品质等差异分析,发现花粉管通道转基因后代材料存在广泛的变异。     

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2.利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株.Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上.对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达.Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织.证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究.     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。     

Improved salt tolerance and seed cotton yield in cotton (<Emphasis Type="Italic">Gossypium hirsutum</Emphasis> L.) by transformation with <Emphasis Type="Italic">betA</Emphasis> gene for glycinebetaine synthesis

Homozygous transgenic cotton (Gossypium hirsutum L.) plants that accumulated glycinebetaine (GB) in larger quantities were more tolerant to salt than wild-type (WT) plants. Four transgenic lines, namely 1, 3, 4, and 5, accumulated significantly higher levels of GB than WT plants did both before and after salt stress. At 175 and 275 mM NaCl, seeds of all the transgenic lines germinated earlier and recorded a higher final germination percentage, and the seedlings grew better, than those of the WT. Under salt stress, all the lines showed some characteristic features of salt tolerance, such as higher leaf relative water content (RWC), higher photosynthesis, better osmotic adjustment (OA), lower percentage of ion leakage, and lower peroxidation of the lipid membrane. Levels of endogenous GB in the transgenic plants were positively correlated with RWC and OA. The results indicate that GB in transgenic cotton plants not only maintains the integrity of cell membranes but also alleviates osmotic stress caused by high salinity. Lastly, the seed cotton yield of transgenic lines 4 and 5 was significantly higher than that of WT plants in saline soil. This research indicates that betA gene has the potential to improve crop’s salt tolerance in areas where salinity is limiting factors for agricultural productivity.     

不同基因型陆地棉亲本及其杂交后代的耐盐性差异

 以Bt抗虫棉选系抗96(父本)、普通陆地棉选系陆58(母本)及其杂交后代(F₁、F₂)为材料,利用不同盐分含量砂培和土培试验比较研究它们苗期的耐盐相对指标和某些耐盐理化指标变化。结果表明,随土壤盐浓度升高,棉花父、母本及其后代叶片内的K⁺含量均降低,而Na⁺含量均明显增加,K⁺/Na⁺显著变小,丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和类胡萝卜素含量均不同程度增加,而净光合速率均降低。各品系的过氧化物酶活性均以0.23％NaCl处理较高,0.46％NaCl处理次之,对照最低。耐盐理化和综合指标皆以陆58最高、抗96最低、F₁和F₂介于其间。表明耐盐性以陆58最强、抗96最弱,F₁和F₂介于父母本之间,杂交后代的耐盐性受其亲本的限制。     

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K⁺/Na⁺差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号, 经PCR、Southern杂交和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性, 各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似, 在2~11 U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y= –3.7738x+57.083, r=0.989^**)。在NaCl和PEG胁迫下, 转基因植株生长正常, 株高比对照提高0.41~1.00 cm, 单株重量比对照增加10%~35%, 说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号, 经PCR、Southern杂交和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性, 各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似, 在2~11 U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y= –3.7738x+57.083, r=0.989^**)。在NaCl和PEG胁迫下, 转基因植株生长正常, 株高比对照提高0.41~1.00 cm, 单株重量比对照增加10%~35%, 说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。     

抗虫棉不同类型品种苗期耐盐理化特性差异研究

 为揭示不同基因型抗虫棉耐盐性差异的生理机制,指导抗虫棉耐盐品种鉴选和盐碱地棉花生产,以耐盐性差异显著的两类转Bt基因抗虫棉品种——耐盐性强的鲁K536、鲁棉研18优选系,耐盐性弱的新棉33B优选系、鲁K1258——为试验材料,利用不同盐分含量砂培与土培试验相结合,比较研究它们苗期的主要理化指标变化。结果表明,在NaCl胁迫下,耐盐性强的品种苗期叶片内的K⁺含量显著高于耐盐性弱的品种,Na⁺含量显著低于耐盐性弱的品种,丙二醛含量也显著低于耐盐性弱的品种,而游离脯氨酸、可溶性糖、类胡萝卜素含量均显著高于耐盐性弱的品种。耐盐性强的品种棉苗的过氧化物酶活性、叶绿素a、b和a+b含量以及净光合速率明显高于耐盐性弱的品种。表明棉花的耐盐性强弱因基因型而异,基因型间的耐盐性差异与丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、类胡萝卜素含量和保护酶活性以及盐离子在叶片中累积量的差异有关。