玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成 和再生条件的初探

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在温室及大田试验中都对棉花黄萎病菌表现出很强的拮抗作用，是一株很有应用潜力的生防菌株。不论是菌丝体本身还是其代谢产物都对多种植物病原菌有很强的抑制作用。对该生防菌株进行深入研究，尤其是分子水平的研究尤为重要。笔者通过研究影响链霉菌原生质体形成的多种条件和因素，包括培养基的选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等，最终成功的制备出了生防菌Men-myco-93-63的原生质体，初步确定了其形成条件：TSB培养基一级培养24h，用SGGP作为二级培养基培养菌丝体40h（补加甘氨酸2%），将菌丝体加入2mg/ml溶菌酶37℃水浴60min后即可得到原生质体，涂在再生培养基R5上再生培养，再生数可达4.8×106个/ml。为该生防菌原生质体的转化、基因表达等研究奠定了重要的基础。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵液防治黄瓜白粉病的作用机理研究

利用透射电镜技术与细胞学相结合的方法探索了Men-myco-93-63发酵液对黄瓜白粉病菌的作用位点,揭示了白粉菌以及寄主细胞在超微结构上发生的变化。利用扫描电镜技术研究了处理前后黄瓜白粉病菌孢子萌发率、菌丝的生长、产孢时间。结果表明:利用透射电镜观察超微结构表明,寄主细胞对病原菌的侵入产生了防卫反应结构,表现为寄主细胞壁加厚,染色加深,在寄主细胞壁下产生结构致密的乳突,在寄主细胞壁与质膜之间有黑色沉积物质。黄瓜白粉菌产生吸器的数目明显减少,吸器畸形,吸器壁增厚,细胞器泡囊化解体,最终吸器坏死,不能从寄主细胞中更好地吸取营养,达到防病的目的。利用扫描电镜观察表明,Men-myco-93-63发酵液使白粉菌的孢子萌发率降低31.51%,在一定程度上抑制了菌丝的生长,寄主体表的菌丝形态表现为菌丝扭曲变形,菌落稀疏变小,延迟其产孢时间约2 d。Men-myco-93-63发酵液能通过直接对菌体作用达到防治黄瓜白粉病的目的。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性成分的初步研究

对拮抗链霉菌Men-myco-93-63固体培养基中活性成分的提取分离进行了初步研究,最后确定乙酸乙酯与丙酮 3∶1(V/V)的混合提取剂为最佳提取剂,并明确了该活性成分属于脂溶性.进行了活性成分存在部位的测定试验,结果发现活性成分既存在于菌丝体中,又存在于培养基中.通过HPLC对活性成分进行检测,确定了其中能够进行纯化的组分.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性成分的初步研究

对拮抗链霉菌Men-myco-93-63固体培养基中活性成分的提取分离进行了初步研究,最后确定乙酸乙酯与丙酮3∶1（V/V）的混合提取剂为最佳提取剂,并明确了该活性成分属于脂溶性。进行了活性成分存在部位的测定试验,结果发现活性成分既存在于菌丝体中,又存在于培养基中。通过HPLC对活性成分进行检测,确定了其中能够进行纯化的组分。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63负调控基因nsdAmgh的克隆及序列分析

nsdA (Negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因.根据天蓝色链霉菌 A3(2)的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 菌株中的该基因,经测序和序列分析表明,由保守序列引物nsdA-2R和nsdA-2L克隆到的Men-myco-93-63 菌株中的该基因 800 bp片段与已知nsdA基因核苷酸保守区域序列同源性达到99%,由全长序列扩增引物nsdA WZ-R和nsdA WZ-L克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框,共编码 369 个氨基酸,与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中的nsdA 基因的核苷酸序列同源性达到100%,氨基酸序列同源性达到99%.该全长基因命名为nsdA_(mgh),其在玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中的发现为阻断该负调控基因以期获得抗生素高产工程菌株提供了重要依据.     

农杆菌介导外源基因在棉花中的表达

用 5～ 6d的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培养 ,菌株质粒中 Gus基因为标记基因 ,NPT 基因为选择基因。在含 0 .1 mg· L- 12 ,4- D和 0 .1 mg· L- 1KT的 MS培养基上共培 48h,转移到添加头孢霉素 50 0 mg· L- 1、卡那霉素 50 mg· L- 1MS培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织 ,70～ 80 d时 ,进行 Gus检测 ,选择 Gus阳性愈伤组织 ,经体细胞分化生成转基因再生植株     

玉米自交系18-599(白)转化受体体系的建立和转barnase基因植株的获得

以抗病优质综合性状优良的玉米自交系18-599（白）为试材,优化其遗传转化受体体系,并进行了barnase基因的转化。结果表明,在基于N6和MS培养基的8个方案中,N6-4培养基是转化受体系统建立的最佳培养基;幼胚的最佳接种长度为1.6 mm;用于转化的幼胚愈伤组织继代次数最好控制在5次之内。利用18-599（白）优化受体体系进行了barnase基因的基因枪转化,用除草剂Basta作筛选剂,其致死浓度为8 mg L^-1,3轮筛选的Basta浓度依次为6、8和6 mg L^-1。对转化植株的分子检测和大田不育性状观察表明,获得了转barnase基因的雄性不育18-599（白）转化植株。     

甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立

利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒pCNR与Δ6脂肪酸脱氢酶基因插入到植物的高效表达载体pCAMBIA2301G。利用在Murashige和Skoog培养基(含有200 mmol L^–1乙酰丁香酮)培养5~7 d的下胚轴外植体与农杆菌株LBA4404共培养63~69 h (pCNR),再于芽诱导培养基上培养3个月诱导芽再生。在最佳条件下,平均转化效率约为1.3%。转化植株的GUS分析和PCR分析结果表明,外源基因成功导入甘蓝型油菜。Southern杂交表明,这些转化子含有目标基因1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸,γ-亚麻酸含量达8.2%。     

含正确木聚糖酶基因转化子的活性筛选

基因工程中,人们很难有效地筛选到带有正确基因的转化子。本文将木聚糖酶基因与pET20b重组,转化BL21(DE3) 大肠杆菌,选取10个转化子,放入0.5ml LB培养基过夜培养,补加9.5ml培养基2.5h后诱导,收集并冻融裂解细胞,检测酶活性,7个转化子酶活性接近或高于阳性对照菌落,认定为阳性转化子,经DNA测序证明基因序列正确。与以往检测基因不同,本研究直接检测转化子酶活性,筛掉不能表达活性酶的突变基因,称为活性筛选方法;其次,用冻融裂解细胞方法简化裂解过程,便于自动化高通量操作;最后,比较初筛酶活性,筛选高酶活转化子。这个过程只要2-3天,具有快速简便特点。     

关键因子对棉花利用农杆菌介导法导入外源基因的影响

用5～6d的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培,将Bt基因和tfdA基因导入棉花。菌株质粒中GUS基因为标记基因,NPTⅡ基因为选择基因。在含有0.1mg/L2,4-D和0.1mg/LKT的MS培养基上共培48h,转移到添加头孢霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织。70～80d时,进行GUS检测,选择GUS阳性愈伤组织,经体细胞胚     

掌叶半夏茎基腐病病原鉴定及其防治药剂筛选

茎基腐病是河北省安国市掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）生产中为害较严重的多发性病害,对该病害的病原菌进行了分离、鉴定、致病性测定和防治药剂的筛选。通过形态鉴定和rDNA-ITS序列分析,将安国掌叶半夏茎基腐病的病原菌鉴定为瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。选用5种常用化学杀菌剂、2种生物杀菌剂和玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物对Py. aphanidermatum进行室内毒力测定,结果表明：35%精甲霜灵ES、玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物、40%氟硅唑EC、99%恶霉灵TC对瓜果腐霉菌丝的生长具有较明显的抑制作用,EC₅₀分别为12.81、41.74、54.16和56.90μg/mL;而1×10 ¹¹芽孢/g枯草芽孢杆菌WP、1×10 ⁶孢子/g寡雄腐霉菌WP、3%甲霜·恶霉灵AS和50%烯酰吗啉WP对该病菌的抑制效果不明显。     

胶霉毒素菌渣的抗菌活性及其应用的研究

旨在研究胶霉毒素菌渣对5种土传病菌的抑制性,寻找到一种胶霉菌素菌渣的综合利用方法。以辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、苹果腐烂病菌、油菜菌核病菌和棉花枯萎病菌为供试菌,采用菌丝生长速率法,对胶霉毒素菌渣的抑菌活性进行了研究,并比较了10%菌渣、10%豆粕、无豆粕和菌渣的培养基对木霉孢子和胶霉毒素含量的影响。以木霉干重孢子数为指标,确定了菌渣最佳添加量。胶霉毒素菌渣对5种土传病菌具有一定的抑菌效果,浓度为40 mg/mL时,对4种土传病菌菌丝的生长的抑制率为100%。胶霉毒素菌渣添加量为30%时,木霉的发酵效果最佳,其干重孢子数达到22亿/g。综上所述,胶霉毒素菌渣具有良好的抑制土传病菌生长的效果,且可作为氮源循环利用培养木霉。     

两株抗香蕉枯萎病菌链霉菌固态发酵条件的优化及混合菌载体的选择

将具有抗香蕉枯萎病菌活性链霉菌通过固体发酵的优化,提高其菌丝生长以及孢子产量,并选择合适的吸附载体,为后期的香蕉枯萎病大田生物防治研究提供技术基础。采用单因子和4因子3水平正交试验法优化白刺链霉菌BWL15-4菌株及不吸水链霉菌BWL58菌株的固态法发酵培养基配方,通过单因子试验探讨了初始pH、接种量以及培养温度对2株菌生长情况的影响,并以孢子存活量多少确定了混合菌株的最适载体。BWL58优化后的固态发酵条件为：pH 7.0左右,接种量2%,发酵温度28℃,培养基配方为：无机盐水占大米重量的150%,黄豆粉占大米重量的5%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的30%。BWL15-4优化后的固体发酵条件为：初始pH 6.3左右,接种量3%,发酵温度29.5℃。培养基配方为无机盐水占大米重量的130%,黄豆粉占大米重量的10%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的20%。非耕作层土与混合菌以2:1的比例混合时,在常温下保存3个月后,孢子数只降低一个数量级。按照此优化条件进行固态发酵,白刺链霉菌BWL58菌株及不吸水链霉菌BWL15-4菌株孢子含量可分别达到1013 cfu/g和1012 cfu/g数量级以上。通过筛选得到了混合菌的最佳填料为非耕作层土。     

高山羊齿孢子的组织培养

[目的]探讨不同灭菌方式对组织培养中高山羊齿孢子成活率的影响以及不同培养基对孢子萌发率的影响.[方法]利用NaClO、NaClO+酒精、升汞、升汞+酒精、升汞+NaClO、酒精这6种不同灭菌方式研究其对高山羊齿孢子成活率的影响;考虑4因素基本培养基、蔗糖、NAA、6-BA进行L16 (44)正交设计,研究其对高山羊齿孢子萌发率的影响.[结果]6种灭菌处理中,NaClO+酒精的灭菌效果最好;酒精的灭菌效果最差;在正交实验中,以1/2 MS+3％蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA为高山羊齿孢子萌发的最佳培养基,萌发率达63.69％,以不加任何激素的MS培养基中萌发率最低.[结论]2种不同的灭菌剂混合使用比单独使用灭菌剂的效果好;基本培养基对高山羊齿孢子萌发率的影响最大,影响顺序为:基本培养基＞6-BA＞蔗糖＞NAA.     

烟草赤星病菌(Alternaria alternata)营养生理研究

研究了6种碳源和6种氮源对烟草赤星病菌[Alternaria alternata(Fr)Keissler]菌丝生长和产孢量的影响。结果表明,不同的碳源和氮源对该病菌菌丝生长和产孢量均有显著影响。病菌在以淀粉为碳源的培养基上菌丝生长最快,乳糖次之;菌丝干重以果糖培养基上最大,乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉次之,无碳对照最低;产孢量以在麦芽糖为碳源的培养基上最高,乳糖次之,无碳对照最低。病菌在以蛋白胨为氮源的培养基上菌丝生长最快,菌丝干重最大,硝酸铵次之,脲最慢;产孢量以在蛋白胨为氮源的培养基上最高,硝酸铵、硫酸铵上次之,脲最低。脲和氯化铵对病菌生长和孢子形成均有抑制作用。     

乌苏里瓦韦(Lepisorus ussuriensis(Regel et Maack)Ching)孢子诱导再生植株的研究

乌苏里瓦韦是一种民间常用的药用蕨类植物,本研究首次建立一种以乌苏里瓦韦孢子为外植体形成完整植株的体系,得到了乌苏里瓦韦体外扩增的方法。为了探究最佳的孢子萌发条件,设计使用6种NAA和6-BA激素组合探究孢子的最佳萌发条件,然后取孢子萌发得到的乌苏里瓦韦叶片,分别接种到不同浓度的NAA和活性炭的组合培养基中,探究乌苏里瓦韦生根的最佳条件。结果表明,乌苏里瓦韦孢子的最佳萌发条件是:1/2MS培养基为基本培养基,附加NAA 0.2 mg/L,6-BA 0.5 mg/L蔗糖30 g/L,琼脂7 g/L;生根的最佳条件为:1/2MS培养基为基本培养基,附加NAA 0.4 mg/L,蔗糖30 g/L,琼脂7 g/L,活性炭1.5 g/L。本研究首次报道了乌苏里瓦韦的体外繁殖形成完整再生植株的方法,为乌苏里瓦韦的人工繁殖,同时为乌苏里瓦韦的可持续开发利用打下坚实基础。     

Physical and Chemical Properties and Antifungal Mechanism of Antifungal Protein Produced by Antagonistic Strain Bacillus subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae

The aim of this study was to investigate inhibition spectrum, characteristics and antifungal mechanism of antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 which possesses strong antagonistic abilities to Verticillium dahilae Kleb., and to offer a theoretical basis for biological control of cotton Verticillium wilt and development of transgenic resistant varieties. The inhibition spectrum of antifungal protein was studied and effects of heat, pH, proteinase, EDTA, inorganic ion on inhibiting activity were also investigated. Furthermore, cellulase and chitinase of the crude antifungal protein were determined and the inhibition to mycelium and spores was studied by different methods. Results indicated that, antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae has broad inhibition spectrum, which had strong inhibition activity to 21 different plant pathogens. It was relatively stable, could tolerate high temperature, EDTA and proteinases and keep activity in the range of pH 5-10, but it was sensitive to Fe3+. The preliminary study on inhibition mechanism demonstrated that the antifungal protein could break down the mycelium and leak the protoplasm, turn the mycelium cells into bigger sacs and inhibit germination of conidia and the inhibition activity was consistent with cellulase and chitinase activity of antifungal protein. Therefore, the inhibition mechanism is deduced as mycelial growth and spore germination are inhibited by cell enzyme activity of the antagonistic protein.     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

摘要:以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L＋MES 400 mg/L＋CH 100 mg/L[7]＋40g/L麦芽糖＋8g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织, 每两周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基（MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+ MES 400 mg/L＋CH 100 mg/L+麦芽糖40g/L+gelrite 2.6g/L,PH5.8）上培养2－3周,然后转接到再生培养基(1/10MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L+ gelrite 2.6g/L,PH5.8)中进行再生成苗。接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织, Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株。在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性。X－gluc染色表明, 少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达。