转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。     

应用PCR技术检测饲料中的转基因成分

成功地从成品饲料中提取DNA，并采用PCR检测技术从中检出35S启动子，NOS终止子，EPSPS耐除草剂基因和CryLA(b)抗虫基因等转基因成分，同时通过扩增玉米（Zea mays)自身zein蛋白基因及大豆（Glycine max)自身lectin基因的引物和阴阳性对照，阴阳性质控，避免产生假阳性，假阴性结果。该方法已在口岸进口饲料转基因检测中得到初步应用。     

应用PCR技术检测饲料中的鱼源性成分

PCR方法在动物源性饲料检测中有很好的应用前景。为了有效检测反刍动物饲料中的鱼源性成分，降低疯牛病传播风险，本研究根据鱼线粒体1DNA 6S rRNA序列设计并筛选了鱼源性特异引物，使用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒提取核酸。PCR特异性检测结果表明，引物NC_Fish2480/2501F/ NC_Fish2565/2586R与牛、羊、猪、鸡成分无交叉反应；灵敏性检测结果表明，该引物可以检测到0.1%的鱼源性成分。该方法的建立为饲料中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。     

转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化

转基因玉米(Zea mays)MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶甲虫(Diabrotica virgifera)和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系,本研究的目的是建立该品系的转化事件特异性定性检测方法的标准.根据转基因玉米MON88017的旁侧序列信息,在左边界的结合位点处设计一系列引物组合,在筛选出最佳引物组合后,优化了该引物组合的反应体系,建立了转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法.全国7家实验室的验证结果表明,该方法能够特异性检测样品中MON88017转化事件,检测灵敏度均达到0.10%以上,且检测结果具有良好的可重复性、可重现性.本方法符合标准检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求,为我国抗虫耐除草剂玉米MON88017检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑.     

转基因玉米pNK603质粒分子的构建与应用

随着转基因植物和相关产品的迅速发展,转基因检测相关标准物质的需求越趋紧迫,本文针对转基因玉米(Zea mays)NK603进行了质粒分子标准物质的构建和适应性研究.通过从转基因玉米NK603阳性材料中定性扩增转化体特异性片段(NK603-108bp)和玉米的内标基因片段(zSSIIb-151 bp),将得到的PCR产物酶切连接后构建到T载体上,经过酶切、PCR扩增和测序三重验证,得到了pNK603质粒分子.选用不同转基因作物的转化体特异性引物和内标准基因引物对构建的pNK603质粒分子的特异性进行检测,PCR结果显示除了特异性目的条带外,并未发现非特异性扩增.同时采用pNK603质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA作定量标准对已知含量的3个水平的转基因基体物质进行转基因含量测定,实时荧光定量PCR结果发现,两种标准所得到测定的数据没有达到统计学差异显著.T检验表明,PCR扩增效率、两种标准所产生的内源或外源基因的标准曲线的斜率和截距没有显著性差异.这些结果表明,pNK603质粒分子可以作为转基因玉米NK603转化体特异性的定性和定量检测用标准物质.     

Semi-nested PCR检测饲料中牛羊源成分

加强对进口饲料中牛羊源成分的检测是防止疯牛病和痒病传播的一个重要措施。根据已发表的牛和羊特异性基因及引物序列，分别设计了1条牛和羊特异性semi-nested PCR引物，并采用semi-nested PCR技术对饲料中的牛和羊成分进行了扩增检测。结果表明，semi-nested PCR能够扩增得到247 bp的牛特异性基因条带和214 bp的羊特异性基因条带，其对饲料中牛或羊源性成分的检测灵敏度可达到0.00001%～0.0001%，比普通PCR检测灵敏度要高出103倍；对牛或羊成分DNA的检测灵敏度可以达到10-6～10-5 ng，比普通PCR检测灵敏度要高出105倍以上。该技术具有快速、灵敏和结果稳定的特点，是检测饲料中痕量牛羊源成分的一种有效方法。     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

转基因玉米LY038转化事件的特异性检测

转基因高赖氨酸玉米LY038在畜禽饲料中已得到广泛应用,但目前还没有关于其侧翼序列扩增及转化事件特异性定性PCR检测方法方面的报道.本研究采用修饰接头连接PCR(modified adapter-linked PCR,M-AL-PCR)技术获得了转基因玉米LY038的外源基因与玉米基因组之间的5′端侧翼序列.据此侧翼 序列设计其转化事件特异性引物,建立了转基因玉米LY038转化事件特异性定性检测方法,扩增片段175bp.以转基因玉米(Zea mays L.)LY038、MIR604、Bt176、Bt11、MON810、MON863、GA21、NK603、非转基因玉米、转基因水稻(Oryza sativa L.)Cry1C*、Cry2A*、转基因大豆(Glycine max)Roundup Ready和转基因油菜(Brassica campestris L.)GT73为材料,验证该方法具有高特异性及灵敏度,最低检测限约为0.1%.研究结果提示,该定性检测体系可准确、快速、高效的检测转基因玉米LY038及其产品.     

多重PCR筛查检测进口转基因玉米

为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。     

用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品*

用从转基因大豆(Glycine max)颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10^14g/μL的溶液。用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeeping gene)。其中,2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因CaMV35S-CTP4基因片段,说明这些食品中含有转基因大豆成分,占被检测食品的76．5％。用巢式PCR和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready和其深加工食品是一种有效的方法。     

免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病研究

利用免疫吸附富集结合经典PCR技术建立了免疫捕捉PCR检测西瓜果斑病菌的检测法，并与直接PCR和生长检测法作了比较。结果表明，所测果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli都产生360bp左右的特异性片段，而10个不同属的对照菌株无特异性片段产生。免疫捕捉PCR检测果斑病菌的灵敏度为50-102cfu/ml，而直接PCR则在104cfu/ml，两者的灵敏度相差100倍左右。免疫捕捉PCR法对市售7种瓜种的检测发现，其中1种哈密瓜种子、2种甜瓜种子和2种西瓜种子检出果斑病菌，与人工气候箱内生长检测的发病结果基本吻合。显示了该法准确、灵敏、快速、低成本等优点。     

采用Nested -PCR从田间和水稻植株上检测稻曲病菌

采用稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的特异性引物，对从发病程度不同的稻田土样、水稻（Oryza sativa）生殖生长初期稻田浮萍(Lemma ssp.)和水稻植株的DNA进行Nested PCR扩增，分析稻曲病菌在稻田的存在和在植株上的附着和侵染，结果显示在稻田中稻曲病菌可以附着在浮萍上，从第一年种植水稻田块的土壤中未检测到稻曲病菌，但在稻田中的浮萍上可以检测到；水稻生殖生长初期剑叶的叶耳间已有稻曲病菌附着和侵染。实验证明PCR技术可以有效地检测田间稻曲病菌。关键词：稻曲病菌(Usitilaginoidea virens); 检测; Nested PCR     

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。     

我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定

依据G enB ank中已报道的甘蔗主要病毒基因组序列设计PCR引物,以采自我国广东、广西、云南、海南等地的甘蔗叶组织总RNA或总DNA抽提物为模板,采用一步法RT-PCR及PCR扩增,对预期扩增产物克隆、测序,根据序列同一性判断测定样品是否含有预期病毒,结果表明,我国南方甘蔗已受到甘蔗花叶病毒(Sugarcane m osa ic v irus,SCM V)、高粱花叶病毒(Sorghum m osa ic v irus,S rM V)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcane ye llow leaf v irus,SCYLV)及甘蔗杆状病毒(Sugarcane B ac illiform V irus,SCBV)的侵染,未发现甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak m osa ic v irus,SCSM V)及甘蔗线条病毒(Sugarcane streak v irus,SSV)。     

定性PCR技术及卡那霉素对8个番茄品种的转基因检测

本研究利用定性PCR技术对8个不同番茄品种中外源基因35S启动子、NPTⅡ基因和NOS终止子进行检测。实验结果表明,阳性对照可以稳定扩增到预期的大小片段,而待检测品种和阴性对照则没有扩增到预期产物。利用100mg／L的卡那霉素对8个不同番茄品种的种子进行萌发试验,再用50mg／L的卡那霉素对番茄外植体（子叶和下胚轴）进行抗性验证,结果显示卡那霉素抗性筛选实验结果与定性PCR结果一致。本文通过对这两种检测方法的优缺点进行研究分析及比较,初步建立了一个对不同品种番茄进行转基因检测的体系。     

猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要: 根据GenBank已登录的猪附红细胞体（M.suis）推测的功能性蛋白基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含M.suis部分ORF2基因的T载体重组质粒（pGEX-T/M.suis）为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法（Taqman FQ-PCR）;对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了检测应用。结果显示：标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;用该方法对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,结果有20份样品为阳性,阳性检出率高于常规PCR方法。     

甘蔗宿根矮化病菌PCR检测技术研究

以甘蔗茎组织总DNA为模板,以16S rRNA基因赖氏细菌属(L eif son ia)通用引物为第一轮引物、甘蔗宿根矮化病菌(L eif son ia xy li subsp.xy li,Lxx)亚种特异引物为第二轮引物建立了Lxx巢式PCR检测技术。根据已报道的Lxx巴西分离物基因组全序列(G enB ank登录号AE 016822.1)设计了扩增致病相关基因片段的3个引物对,经多种组合进行了RCR检验,筛选出两个特异性好、灵敏高的引物对,建立了Lxx的多重PCR检测技术。克隆测序表明,PCR产物与巴西分离物基因组相应区段同一率为99%以上,从而证实了上述PCR技术的正确性。检测结果表明,广东样品的阳性率为90%,海南样品的阳性率为60%。     

三重巢式PCR技术检测抗草甘膦转基因大豆深加工产品

实验以7种具有代表性的含有大豆成分的深加工产品(卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆粗油、大豆精炼油和大豆色拉油)作为样品进行定性检测，第一轮三重PCR均未能扩增出任何大豆成分，其灵敏度为0.5％。第二轮三重PCR可以扩增出除大豆精炼油和色拉油以外的所有深加工产品的内源基因Lectin、35S-CTP和EPSPS-NOS基因，其检测灵敏度达到0.005％，结果提示三重巢式PCR检测方法适用于大豆深加工产品的定性检测。