应用PCR技术检测饲料中的鱼源性成分

PCR方法在动物源性饲料检测中有很好的应用前景。为了有效检测反刍动物饲料中的鱼源性成分，降低疯牛病传播风险，本研究根据鱼线粒体1DNA 6S rRNA序列设计并筛选了鱼源性特异引物，使用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒提取核酸。PCR特异性检测结果表明，引物NC_Fish2480/2501F/ NC_Fish2565/2586R与牛、羊、猪、鸡成分无交叉反应；灵敏性检测结果表明，该引物可以检测到0.1%的鱼源性成分。该方法的建立为饲料中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。     

Semi-nested PCR检测饲料中牛羊源成分

加强对进口饲料中牛羊源成分的检测是防止疯牛病和痒病传播的一个重要措施。根据已发表的牛和羊特异性基因及引物序列，分别设计了1条牛和羊特异性semi-nested PCR引物，并采用semi-nested PCR技术对饲料中的牛和羊成分进行了扩增检测。结果表明，semi-nested PCR能够扩增得到247 bp的牛特异性基因条带和214 bp的羊特异性基因条带，其对饲料中牛或羊源性成分的检测灵敏度可达到0.00001%～0.0001%，比普通PCR检测灵敏度要高出103倍；对牛或羊成分DNA的检测灵敏度可以达到10-6～10-5 ng，比普通PCR检测灵敏度要高出105倍以上。该技术具有快速、灵敏和结果稳定的特点，是检测饲料中痕量牛羊源成分的一种有效方法。     

荧光RT-PCR鉴别诊断O型与AsiaⅠ型口蹄疫病毒方法的建立

从GenBank中获取多个口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）基因组序列,进行多序列比对之后,设计对应于口蹄疫病毒的3D、VP3和3C区域的引物和探针,分别建立了FMDV群特异性实时荧光RT-PCR、O型特异性实时荧光RT-PCR和AsiaⅠ型特异性实时荧光RT-PCR检测方法。三种FMDV实时荧光RT-PCR在Lightcycler荧光PCR仪上扩增均出现标准的S型曲线,并且具有良好的特异性,可以很好地将FMDV与传染性牛鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus）、猪传染性胃肠炎病毒（Swine transmissible gastroenteritis virus）、赤羽病病毒（Akabane virus）和猪呼吸系统冠状病毒（Porcine respiratory corona virus）区分。FMDV群特异性实时荧光RT-PCR可以成功扩增O型（O1和O2毒株）和AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2毒株）FMDV;O型特异性实时荧光RT-PCR可成功扩增O型（O1和O2毒株）FMDV,AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2毒株）FMDV为阴性;AsiaⅠ型特异性实时荧光RT-PCR可成功扩增AsiaⅠ型（AsiaⅠ1和AsiaⅠ2毒株）FMDV,O型（O1和O2毒株）FMDV为阴性。FMDV群特异性实时荧光RT-PCR、O型特异性实时荧光RT-PCR和AsiaⅠ型特异性实时荧光RT-PCR都可以检测到10个拷贝的模板,灵敏度接近检测方法的极限。检测时间短,从加样到反应结束只需要70 min。该方法有潜力用于FMDV的实验室筛查与鉴别诊断。     

荧光RT-PCR鉴别诊断O型与Asia I型口蹄疫病毒方法的建立

从GenBank中获取多个口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）基因组序列,进行多序列比对之后,设计对应于口蹄疫病毒的3D、VP3和3C区域的引物和探针,分别建立了FMDV群特异性实时荧光RT-PCR、O型特异性实时荧光RT-PCR和Asia I型特异性实时荧光RT-PCR检测方法。三种FMDV实时荧光RT-PCR在Lightcycler荧光PCR仪上扩增均出现标准的S型曲线,并且具有良好的特异性,可以很好地将FMDV与传染性牛鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus）、猪传染眭胃肠炎病毒（Swine transmissible gastroenteritis virus）、赤羽病病毒（Akabane virus）和猪呼吸系统冠状病毒（Porcine respiratory corona virus）区分。FMDV群特异性实时荧光RT-PCR可以成功扩增O型（O1和O2毒株）和Asia I型（Asia I1和Asia I2毒株）FMDV;O型特异性实时荧光RT-PCR可成功扩增O型（O1和O2毒株）FMDV,Asia I型（Asia I1和Asia I2毒株）FMDV为阴性;Asia I型特异性实时荧光RT-PCR可成功扩增Asia I型（Asia I1和Asia I2毒株）FMDV,O型（O1和O2毒株）FMDV为阴性。FMDV群特异性实时荧光RT-PCR、O型特异性实时荧光RT-PCR和Asia I型特异性实时荧光RT-PCR都可以检测到10个拷贝的模板,灵敏度接近检测方法的极限。检测时间短,从加样到反应结束只需要70min。该方法有潜力用于FMDV的实验室筛查与鉴别诊断。     

利用RNA干扰抑制牛胎儿成纤维细胞中朊蛋白基因prnp的表达

疯牛病是由朊蛋白基因prnp编码的正常朊蛋白PrPc发生构象变化为致病性朊蛋白PrPsc而引起的传染性疾病,PrPsc在中枢神经的聚集引发了动物的传染性海绵状脑病.降低(下调)PrPc的表达量使其减少向PrPsc转化,是抑制疯牛病的有效途径.本研究利用RNAi技术,针对牛源cDNA序列设计了3段PrPc干扰序列及一个阴性对照,将其连接到RNA干扰载体pGenesil-1上,转染牛胎儿成纤维细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测有干扰序列的有效性,并用700μg/mL G418对细胞进行药物筛选.结果表明,3对干扰片段的抑制效率分别是51.2%、85.7%和74.6%,阴性对照的干扰效率是2.05%,得到了一个较为有效地干扰片段,并且筛选出了稳定转染的细胞单克隆,为进一步的体细胞核移植提供供体细胞.     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要:按照GenBank上公布的兔出血症病毒（RHDV）基因序列设计一对引物，以RHDV发病兔的新鲜肝为材料，提取总RNA，进行cDNA的合成和PCR扩增，结果能扩增出与预期的269bp大小一致的片段，该产物序列与公布的RHDV基因序列有95.8%～98.5%的同源性，表明已成功建立了RHDV RT-PCR检测方法。用该方法和血凝实验（HA）对兔出血症发病兔各组织脏器进行检测，结果表明，发病死亡兔各脏器中，HA检测阳性的病料为肝脏、肾脏、脾脏、血液、肺；RT-PCR检测除粪便外，其它均为阳性，其敏感性是HA的4×104倍。RT-PCR方法检测RHDV敏感度高、特异性强、重复性好，不仅可用于RHD临床诊断和流行病学调查，而且在兔肉等兔类产品的检疫方面具有很好的应用前景。     

石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒(NNV)检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物,提取斜带石斑鱼的总RNA,利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性,同时对反应温度和反应时间进行优化,并对现场20尾鱼苗进行了检测。结果表明:筛选出一组高特异性的引物,在61℃条件下恒温反应20 min可以完成检测;在反应试管中添加钙黄绿素,可利用荧光反应现象进行结果判定,且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应;对20尾鱼苗进行了现场检测,检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法,方法特异性强、反应时间短、操作简单,为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。     

实时荧光定量PCR检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及应用

研究建立检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的实时荧光定量PCR方法,并运用建立的检测方法对临床病料进行应用检测.根据GenBank报道的胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3'端391 bp核苷酸保守序列,设计1对特异引物扩增117 bp核苷酸片段,建立检测APP的实时荧光定量PCR方法和标准曲线,并利用该方法对收集肺脏组织和人工感染组织材料进行APP核酸定量检测.结果表明,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好敏感性、特异性、重复性和临床应用性.该方法的建立为APP的临床高效诊断和APP感染的发生、发展和转归研究提供了一种有效手段.     

荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用

介绍了一种应用荧光显色的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的检测方法.该方法使用了针对靶序列M+N基因的一组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应.在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒.几种其它病原的核酸也被用来比较这两种方法的特异性,两种方法只能检测PRRSV.在荧光显色剂应用试验中,证实0.05 mmol/L钙黄绿素以及0.6 mmol/L锰离子可以用于LAMP扩增产物的判断,并且其判断结果与浊度判断结果一致.在对103个临床血液样本的检测中,RT-LAMP与RT-PCR检出的阳性样本数量分别是56个和48个.结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可以快速检测PRRSV.     

多重实时RT-PCR快速检测新型甲型H1N1流感病毒

从GenBank中获取新型甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)HA和NA基因序列,通过多重序列比对之后,设计合成H1和N1基因特异性的引物和探针,用来建立新的甲型H1N1亚型流感病毒的多重实时RT-PCR检测方法.合成的两条荧光探针分别标记FAM和CY5荧光报告基团,荧光淬灭均使用BHQ基团.多重实时RT-PCR实验在ABl7500实时PCR仪上进行,经过40个循环的扩增之后,阳性对照出现标准的S型曲线,并且具有良好的特异性,可以很好地将新的甲型H1N1与传统的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2等流感病毒区分.多重实时RT-PCR可以检测到10个拷贝的模板,灵敏度接近检测方法的极限.检测时间短,从加样到反应结束只需要90 min.在对243例发热病人临床样品检测过程中发现7例阳性,1351份猪临床样品检测中未发现阳性,该检测结果和采用中国检验检疫科学研究院研制的试剂盒获得的检测结果一致.本研究所建立的快速、准确和高敏感性的多重实时RT-PCR方法非常适用于新型甲型H1N1流感病毒的实验室筛查.     

牛Phlda2基因的组织表达及生物信息学分析

在人、鼠和猪中,Phlda2基因是一个母源表达的印记基因,编码一种胞浆蛋白,具有与血小板同源的结构域。在牛中,Phlda2基因的结构和功能还不清楚。本研究首先利用RT-PCR方法对Phlda2基因在牛组织中的表达进行了分析,进而采用生物信息学方法对牛Phlda2基因的分子进化、启动子及蛋白的高级结构进行了分析和预测。结果表明,Phlda2基因在牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盘10个组织中均有表达。对包括人、小鼠、牛、猪、原鸡、非洲爪蝉、斑马鱼和袋鼠在内的8种动物Phlda2基因mRNA序列进化进行分析,发现这8种动物的遗传距离小于0.435,且牛和猪遗传距离最近,为0.148,与基因系统进化树分析的结果一致。牛Phlda2基因的启动子最可能位于该基因起始密码子上游487-737bp区域,包括20种转录因子结合位点。牛Phlda2基因编码亲水性蛋白,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;蛋白三级结构包括一个由β片层和α-螺旋构成的血小板同源结构域（PH）。以上研究结果将为进一步研究Phlda2基因的功能和分析基因表达调控的分子机理奠定基础。     

牛Nanog 原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。     

五指山猪不同组织中肌细胞生成素基因Myf4及生肌调节因子Myf6的表达

本文通过运用Real-time PCR技术,检测肌细胞生成素基因Myf4和生肌调节因子Myf6在出生后的第30天、第210天、第360天（出生到体成熟）的五指山猪肌肉组织中的表达变化,以及Myf4、Myf6在体成熟五指山猪肌肉、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠组织中mRNA相对表达情况。结果表明：Myf4及Myf6基因在五指山猪出生后在肌肉组织中的mRNA表达水平随着五指山猪的生长年龄生长而显著增长（p〈0.05）;Myf4及Myf6基因在成年五指山猪以上8种组织中均有表达,其中在肌肉组织中相对表达量最高。本研究结果将为五指山猪肌肉生长发育及矮小性状形成机理提供参考。     

Development of a dot blot assay for the rapid detection of central nervous system tissue on meat and contact surfaces

As a potential transmitter of bovine spongiform encephalopathy (BSE), tissue from bovine central nervous system (CNS) is not accepted in meat and meat products. Western blot analysis of the CNS marker myelin proteolipid protein (PLP) detects CNS contamination selectively and sensitively. In this study, a rapid dot blot assay using an anti-PLP antibody was developed to screen CNS contamination of meat and contact surfaces. The detection limit was 0.01% bovine brain in minced bovine muscle. When applied to a swab test, down to 0.5 mg of CNS tissue on meat or other surfaces was detectable. Other offal tissues or peripheral nerves did not interfere with the assay. The test allows a differentiation between mammalian and avian CNS but not among mammalian species. The swab test was applied immediately after slaughtering at several areas of the bovine head. CNS was not detectable at any region which may enter the food chain.     

磺胺甲噁唑单克隆抗体的研制及免疫金标试纸检测方法的建立

用磺胺甲噁唑人工免疫原（BSA-SMZ）免疫BALB/C小鼠（Mus muscalus）,细胞融合技术筛选抗磺胺甲噁唑单克隆抗体（SMZmAb）杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SMZ mAb,并鉴定其免疫学特性;应用SMZmAb研制SMZ残留快速检测金标试纸（SMZ-strip）,并测定其性能。结果表明,筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的3G6株间接ELISA效价细胞培养上清为1∶8.1×102,腹水为1∶6.4×105,亲和常数（Ka）为3.07×109 L/mol,对SMZ的半数抑制浓度（IC50）为12.4 μg/L,与磺胺嘧啶的交叉反应率（CR%）为2.84%,与其它磺胺类药物无交叉反应;SMZ-strip目测检测限为6 μg/L;其敏感性与竞争ELISA试剂盒相当,符合率为100%;SMZ-strip具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于SMZ残留快速检测的推广应用。     

水牛转录因子Klf4基因编码区序列克隆及在真核细胞中表达研究

Krtippel样因子4依脾）在调控细胞增殖、分化和胚胎发育中有重要作用,也是生产诱导多能干细胞（iPSC）重要的转录因子之一。本研究对水牛K牌进行克隆和表达研究,为生产水牛iPSC和研究其在体细胞重编程中的机理奠定基础。采用RT—PCR克隆并分析水牛K牌编码区序YIJ（CDS）;mRNA水平和蛋白水平检测K牌在水牛胎儿成纤维细胞（BFF）和胃上皮细胞（BSEC）中的表达情况;构建表达水牛K孵的逆转录病毒载体（pMX—Klf4）、病毒感染BFF、免疫荧光技术分析外源K脾在BFF中的表达情况。结果表明：水牛CDS全长1434bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为99％、97％、92％$N92％,蛋白结构保守;内源Klf4在BFF和BSEC中都有表达,pMX介导的外源K脾能在BFF中表达。     

皖西白鹅肝脏中GHR，IGF-1和 IGF-1R基因的表达及与朗德鹅的比较

选择90日龄的皖西白鹅和朗德鹅各20只,取肝脏组织。采用半定量逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）的方法,以β-actin为内标,对肝脏组织中生长激素受体（GHR）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、胰岛素样生长因子-1型受体（IGF-1R）的mRNA表达量分别进行比较分析,并分别与鹅的肝脏重及肝重率进行相关性分析。结果表明：皖西白鹅的肝脏重和肝重率都显著大于朗德鹅（p<0.05）;皖西白鹅肝脏中IGF-1的mRNA表达明显高于朗德鹅（p<0.01）;而GHR、IGF-1R mRNA在两品种间没有显著差异。体重与肝脏重显著正相关（r = 0.35,p<0.05）,肝重率与肝脏中IGF-1的mRNA的表达显著正相关（r = 0.67,p<0.01）,而与GHR、IGF-1R mRNA没有显著的相关性。结果提示：（1）90日龄的皖西白鹅肝脏生长优于朗德鹅;（2）两品种鹅肝脏生长的差异可能与肝脏中IGF-1 mRNA表达的差异有关。     

Ethion degradation and its correlation with microbial and biochemical parameters of tea soils

Ethion, a highly persistent insecticide in soil, is extensively used in tea cultivation in the tropics. The studies on the environmental impact of ethion in tea soil ecosystems are scanty. Silty loam and sandy loam soils from tea fields of Dooars (Typic Uderthents) and Hill (Typic Dystrudepts), respectively, were investigated for the degradation and effect of ethion application on soil microbial and biochemical variables under controlled laboratory conditions. Ethion degraded faster in the Hill soil than in the Dooars soil. Higher temperature (30°C) aided in faster degradation due to the increased microbial activity in the soils. Ethion application at field rate (FR) had lower half-lives (70 days at 20°C and 42.3 days at 30°C for Dooars soil; 65.4 days at 20°C and 39 days at 30°C for Hill soil) than at ten times FR (10FR; 75.2 days at 20°C and 44.2 days at 30°C for Dooars soil; 70 days at 20°C and 41.8 days at 30°C for Hill soil). Soil microbial biomass carbon, ergosterol content, fluorescein diacetate hydrolyzing and β-glucosidase activities declined in all the treatment combinations up to day 60 for both FR and 10FR doses at 20°C, irrespective of the soil types. At 30°C, the decreasing trend was observed up to day 30 for both the soils. The toxicological effect of ethion on microbiological and biochemical parameters persisted till their corresponding half-lives. The microbial metabolic quotient and microbial respiration quotient were altered, but was short-lived, indicating ethion induced disturbances. The recovery of the depressive action at 10FR ethion spiking on the studied variables was of slightly longer duration than noticed at FR application, although the depressive effect was overcoming after the respective half-lives of ethion. The microbial and biochemical soil parameters were negatively correlated with application of ethion up to day 60 of incubation.     

白羽王鸽肌生成抑制因子基因的多态性与组织表达

肌生成抑制因子在抑制成肌细胞的增殖与分化中起着重要作用。本文采用PCR-SSCP与实时定量RT-PCR方法分析白羽王鸽肌生成抑制因子（MSTN基因）的多态性和在脑、肝脏、胸肌组织中的mRNA表达水平及其与体重的相关性。结果表明在白羽王鸽MSTN基因的外显子1和外显子3区域分别检测到一个多态位点,且均属于沉默突变;肝脏、肌肉和脑组织中MSTN基因的表达量依次为肝脏〉脑〉肌肉,且差异极显著。而对不同发育阶段的乳鸽研究发现,随着乳鸽日龄（1～25d）的增长,MSTN基因在各组织中的表达量无明显的线性变化规律。该结果为进一步确定MSTN基因的作用机理提供了新的实验依据。     

Thermogravimetric evaluation of chitin degradation in soil: implication for the enhancement of ammonification of native organic nitrogen by chitin addition

Degradation of chitin, which is an aminopolysaccharide used as a soil amendment, has been often monitored in soil via its degradation products such as carbon dioxide and ammonium. We report here the applicability of thermogravimetry to measure the amount of chitin added to soil. The maximum pyrolysis rate of the upland surface soil of Brown Forest soil supplemented with chitin was strongly correlated with added chitin content (r = 0.999) when the content exceeded 6.0 g kg^?1. The maximum pyrolysis rates of chitin-added soil (around 385°C) was distinctive from those of soil supplemented with cellulose, chitosan, N-acetylglucosamine, and N,N’-diacetylchitobiose (around 340°C, 300°C, 200°C, and 240°C, respectively), indicating the specific detection of chitin. Soil incubation study demonstrated that 60 g kg^?1 chitin added to the soil declined exponentially (r = 0.993) within days and could not be detected at 90 days after the addition of chitin. Total carbon (C) content also decreased within days whereas total nitrogen (N) remained almost constant over the 90 days. The amount of ammonium-N increased in the initial 30 days after the addition of chitin and reached about 3.6 g kg^?1, which corresponded to the amount of N in the added chitin (4.1 g kg^?1) while the amount of nitrite-N and nitrate-N were below 2.0 and 15 mg kg^?1, respectively. Comparison of the measured ammonium-N and total-C contents with those calculated from the measured chitin-content implied that addition of chitin enhanced degradation of native organic compounds in soil.