辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物（ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC）的基因组。分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9717个核苷酸（nt）序列（GenBank登录号：GQ981316）。在核苷酸序列的第164位～第9270位存在一个大的开放阅读框（ORF）,编码一个多聚蛋白（分子量为350.44kD）。近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF（pretty interesting potyviridae ORF,PIPO）存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2892位～第3110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽（分子量为8.26kD）。ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率。本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位。     

马铃薯Y病毒HC-Pro基因的克隆、序列分析以及原核表达

本研究以马铃薯Ｙ病毒中国株系（ＰＶＹ－Ｃ） ＲＮＡ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆了ＰＶＹ－Ｃ ＨＣ－Ｐｒｏ基因,并对其进行了序列分析,测序结果表明ＰＶＹ－ＣＨＣ－Ｐｒｏ基因全长为１３６８ｎｔ,编码一个含４５６个氨基酸的蛋白。它与ＰＶＹ其它株系的同源性高于与马铃薯Ｙ病毒属其它种病毒的同源性,与所报道的ＰＶＹｎ株系的碱基及氨基酸序列同源性均为９６％,推测ＰＶＹ－Ｃ可能是ＰＶＹｎ株系或它的一个近缘株系。Ｓ     

鸡传染性法氏囊病毒Ts、OH毒株、鱼传染性胰脏坏死病毒DRT毒株的同源性分析

用幼鸡成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Ts毒株,病毒颗粒经提纯后提取基因组dsRNA.根据已报道的加拿大OH株序列设计引物,用RT-PCR进行 cDNA扩增,获得976 bp、774 bp和997 bp的三个部分重叠的片段,分别克隆于pGEM-Teasy载体,利用SP6,T7特异引物及PCR引物进行序列分析,并连接为一个完整的大片段.结果表明,所克隆片段为2 665 bp的IBDV VP1基因的大开放读框.序列分析表明:Ts株与OH株的核苷酸序列同源性为91 %;与DRT毒株的氨基酸序列同源性为42.5 %.尽管Ts株与DRT株的整体同源性很低,但在VP1蛋白的中部仍发现有高同源区段.在两种病毒中均发现与GTP结合蛋白、依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)相关的保守序列.然而,与单链RNA病毒不同的是:作为RdRp家族特征的G-D-D序列在两种病毒中都未发现.     

从烟草上分离的中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

本研究从具有典型曲叶病症状的广西靖西烟草病植株上分离到病毒分离物JX-2,全基因组序列测定结果表明,JX-2DNA．A全长2738个核苷酸,共编码6个开放阅读框架（openreadingframes,ORFs）,其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。BLAST结果表明,JX-2DNA—A与中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV）各分离物的相似性在93．0％-99．7％之间,其中与ToLCCNV广西番茄分离物ToLCCNV．G32的相似性最高,达99．7％,而与其它双生病毒的同源性均在88．0％以下,表明Jx-2是ToLCCNV的一个分离物。基于Jx-2和已报道的双生病毒属代表种DNA-A全基因组核苷酸序列构建的系统进化树显示,JX-2与ToLCCNV-G32分离物的亲缘关系最近,并与ToLCCNV其它分离物形成一个分支,而与其它10种双生病毒的亲缘关系均相对较远。利用双生病毒卫星DNAβ的特异性引物β01／β02在Jx-2样品中扩增到DNAβ分子（JX-2β）,全长为1341个核苷酸,其互补链编码1个ORF（即βC1）,并包含一个富含A序列和一个卫星病毒保守序列。序列分析表明,JX-2β与ToLCCNV伴随的DNAβ的相似性在91．0％～96．1％之间,其中与ToLCCNV-G61DNAβ和ToLCCNV—G18DNAβ的相似性最高（96．1％）,与其它卫星DNAβ的相似性均低于61．8％。基于JX-2β全基因组核苷酸序列构建的系统进化关系树显示,JX-29与ToLCCNVG61分离物伴随的DNAβ亲缘关系最近,并形成一个独立的分支,再与ToLCCNV其余两个分离物伴随的DNAβ形成一个较大的分支。这是首次报道从烟草中分离到的中国番茄曲叶病毒及其伴随卫星DNA分子的全基因组结构特征。     

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化

为了降低烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和马铃薯Y病毒（potato irus Y,PVY）复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV—CP和PVY—CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300—35S—OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功。并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草。     

中国台湾番茄曲叶病毒侵染引起广东番茄黄化曲叶病

广东汕头番茄(Lycopersicon eseulentum)上发生的黄化曲叶病毒病,田间症状表现为病株明显矮化、病叶褪绿黄化、叶小且卷曲和叶质较脆硬。对该病毒代表分离物(BS)基因组DNA-A克隆和测定结果表明,其全长为2740nt(GenBank acces-sion No.DQ237918),具有菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,有6个ORFs,分别位于病毒链上的AV1、AV2及位于互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4;在基因AV2与AC1之间有269nt的非编码区。BLAST结果显示,BSDNA-A与Begomovirus中来自亚洲的病毒同源性较高,而与美洲、非洲等地的相对较低;其中与中国台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)DNA-A全序列同源性最高,为97.7%,而二者的AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4基因及IR的同源性分别为98.6%、98.0%、98.0%、97.5%、96.3%、98.6%和96.6%,推导编码的6个蛋白的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、97.5%、95.6%、91.8%和99.0%%。全序列系统进化关系树显示,BS与ToLCTWV的亲缘关系最近,并形成一个独立分支,再与广东番茄曲叶病毒G2(Tomato leaf curl Guangdong virus G2,ToLCGDV-[G2]和广东番茄曲叶病毒G3(Tomato leaf curl Guangdong virus G3,ToLCGDV-[G3]形成一个大的分支,而与其它33种Begomovirus病毒的亲缘关系均相对较远。这些结果表明,BS应是ToLCTWV的一个分离物。     

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒（PVY）在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白（CP）基因为模板扩增300bp和354bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与wyCP同源的hairpin RNA。结果表明,瞬时表达的hairpin RNA有效干涉了PVY侵染。     

侵染云南白肋烟的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征*

从中国云南省大理地区表现曲叶症状的白肋烟(Nicotina tabacum White Burley)上分离到病毒分离物Y43,该病毒可经烟粉虱(Bemisia tabaci)及嫁接传播。用15种粉虱传双生病毒的单抗对病样进行TAS-ELISA检测,结果表明,该病毒属菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒。对DNA-A1.7kb基因组序列测定和分析表明,Y43与中国广西报道的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato ycllow lcafcurl China virus,TYLCCNV)同源性达89％,其中外壳蛋白(CP)氨基酸同源性达96％,因此Y43应为TYLCCNV的一个新分离物。进一步研究发现,Y43还伴随着一个长l349nt的卫星DNA分子(DNAβ)。Y43 DNAβ与AYVV DNAβ、BYVMV DNAβ和CLCuV DNAβ的同源性较低,而与中国分离的烟草曲叶病毒Y5 DNAβ和Y8 DNAβ的亲缘关系较近。DNAβ可能编码7个分子量超过3．5kD的ORF,其中Cl推测为有功能的ORF。     

传染性喉气管炎病毒北京株胸苷激酶基因的克隆和序列分析

传染性喉气管炎病毒（infectous laryngotracheitis virus,ILTV)是一种能感染鸡（Gallina)群，导致产生急性上呼吸道感染的α－疱疹病毒。ILTV对鸡群的感染率约为100％，致死率约为40％，致死率约为40％，胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因是疱疹病毒的一个重要的毒力基因，该基因的删除有助于构建缺失tk基因的重组ILTV。为了得到缺失tk的重组ILTV病毒。报道了ILTV北京E2株的tk基因的克隆和测序，并分析了该序列与其它已经发表的其它ILTV毒株tk基因之间的同源性。由DNA序列推导TK的氨基酸序列，并将该序列与其它疱疹毒TK氨基酸序列的同源性进行了分析，可以看到这疱疹病毒TK氨基酸序列在某些区域出现较高的同源性。     

狂犬病病毒3aG株核蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

从狂犬病病毒感染的ＢＨＫ细胞裂解上清液中快速提取病毒ＲＮＡ,用反转录－聚合式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到编码核蛋白完整结构基因的ｃＤＮＡ,进一步将此基因克隆入ｐＵＣ１８中,进行核苷酸序列分析,并与国外ＰＶ、ＣＶＳ、ＳＡＤＢ１９株以及国内５ａＧ株的Ｎ基因序列进行了同源性比较,证明所克隆Ｎ基因正确。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性的影响

以GFP叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）为材料,在实验室条件下研究了叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）在茎叶降解过程中及完全降解后对土壤微生物主要类群（细菌、真菌、放线菌）的影响,并对相关的土壤酶活性进行了分析。结果表明,在烟草茎叶降解过程中及完全降解后：（1）叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）对微生物的数量影响不显著;（2）土壤微生物总量相比为细菌〉放线菌〉真菌;（3）叶绿体转基因烟草茎叶降解对土壤酶活性没有显著影响;（4）GFP基因没有水平转移到土壤微生物基因组中。以上结果显示GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性没有显著的影响。     

桃脂氧合酶(LOX)基因家族cDNA全长克隆与序列分析

根据脂氧合酶保守序列设计的简并引物从桃（瑞蟠5号）果肉总RNA中扩增出795bp的脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）基因的保守序列,并结合GeneBank中公开的LOX基因的EST序列经Blast比对分析、序列组装之后设计基因特异引物（GSP）。利用RACE技术共获得3条不同的桃LOX基因cDNA全长序列,分别命名为PpLox1-3。序列分析结果表明,这3个桃LOX基因家族成员与其他植物的LOX基因尽管在核酸水平上的差异比较大,但在蛋白水平上却有较高的同源性。通过对桃LOX基因蛋白序列和其他植物LOX进行系统进化树分析,发现PpLox1属于13-LOX类型,PpLox2-3属于9-LOX类型。     

嗜水气单胞菌粘附素和外膜蛋白A基因克隆与结构预测

采用PCR方法扩增嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）外膜蛋白相关基因,即粘附素（Aha）、外膜蛋白A（OmpA）基因全长序列,进行DNA测序及生物信息学分析。结果表明：Aha基因长1 314 bp,推导编码355 aa,5～24 aa区域为跨膜螺旋,26～355 aa区域为革兰氏阴性菌孔蛋白结构域（PF00267）,Aha蛋白三级结构与模板（PDB：1PHO_A）相似性达28.21%;OmpA基因长1 102 bp,推导编码338 aa,含有OmpA跨膜结构域（PF01389）和OmpA结构域（PF00691）,预测OmpA蛋白抗原表位位于64～69 aa、160～171 aa、244～249 aa、259～274 aa和295～301 aa区域,OmpA蛋白三级结构OmpA跨膜结构域和OmpA结构域与模板（PDB：1BXW_A,PDB：4ERH_A）相似性分别为27.45%和57.58%;进一步采用拉马钱德兰图（Ramachandran plot）检测分析,与Aha、OmpA基因蛋白三级结构预测结果一致。本研究有助于理解嗜水气单胞菌致病的分子机制,为鱼类疾病防治及疫苗应用提供科学参考。     

基于AOX基因探讨隐孢子虫分离株种系发育关系

本实验以线粒体功能性蛋白基因alternative oxidase（AOX）作为研究对象，对隐孢子虫分离株进行扩增测序，用Clustal X1.81对扩增的序列与GenBank下载的相关序列进行比对，用Paup4.0程序中邻接法（neighbor-joining method，NJ）、最大简约法（Parsimony, MP）建树，同时用PUZZLE程序Version 4.1构建最大似然树（Maximum Likelihood, ML），以确定不同隐孢子虫分离株之间的进化关系，并与18SrRNA和HSP70基因构建的进化树作参照，进而评价AOX这一基因序列是否适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系分析的基因座。结果：通过AOX构建的进化树将隐孢子虫分为两大类：C.baileyi和C.meleagridis关系更为密切两者处于一个分枝，C.hominis、C.suis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个分枝上。不同隐孢子虫之间的同源性介于91.8％～99.6％，能有效区分隐孢子虫不同基因型。因此，AOX基因序列也可作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。     

薄片牡蛎的核型及18S-28S核糖体rRNA基因的染色体定位

以薄片牡蛎（Dendostrea folium）成体鳃组织为材料制备有丝分裂中期染色体标本,对其染色体核型进行了分析,并运用荧光原位杂交技术（FISH）将18S-28S核糖体RNA基因定位于中期染色体上。FISH探针是通过PCR扩增介于18S-28S rRNA基因之间的ITS和5.8S rRNA基因序列,并在PCR扩增过程中掺入了Biotin-11-dUTP进行生物素标记。结果显示,薄片牡蛎的单倍染色体数目为n=10,全部为中部着丝粒染色体。与大多数已知巨蛎属牡蛎的染色体核型相似。ITS探针在薄片牡蛎中期分裂体相上产生两簇FISH信号,分别杂交于2号染色体短臂的近端粒区域。本研究首次报道了薄片牡蛎的中期染色体核型以及18S-28S核糖体RNA基因在染色体上的定位。     

马铃薯花青素转录激活基因stmyc的克隆与表达分析

根据GenBank 核酸数据库中报道的紫苏myc mRNA基因保守序列设计引物，用RT-PCR方法从紫色马铃薯紫皮RNA中获得花青素转录激活类基因stmyc的5’端保守区域， 通过3’-RACE获得长为600bp左右的序列。测序结果表明：基因全长1106bp，含有完整的阅读框，编码326个氨基酸，命名为stmyc，其编码的蛋白与紫苏myc基因编码蛋白的同源性02为46.98%，并具有典型的bHLH结构域。RT-PCR表达分析结果显示stmyc基因在紫色马铃薯皮、肉、茎、叶、根中都有表达，其中在紫茎中的表达量最高，紫皮中表达量最低；且该基因在白色马铃薯的皮、叶和肉中都有表达，推测该基因在马铃薯中为组成型表达。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF（LEAFY同源基因）和PTAG（AGAMOUS同源基因）是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将35S：：PTLF-PTAG-IR导入烟草（Nicotiana tabacum）。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL（LEAFY同源基因）和NAG1（AGAMOUS同源基因）的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明：与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S：：PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。