马铃薯花青素转录激活基因(stmyc)的克隆及表达分析

花青素（anthocyanin）为糖苷类物质,属于类黄酮色素。在花青素生物合成途径中,调控基因主要编码R2R3-MYB、bHLH和WD40转录因子,共同调控花青素合成的结构基因的表达,进而控制花青素在植物中的时空表达和沉积的模式（Holton and comish,1995）。本研究以紫色马铃薯为材料,克隆花色素合成的转录激活基因stmyc并研究其表达模式,为阐明马铃薯花色素生物合成和沉积机制提供依据。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA（命名为HbC2）。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5＇-UTR和232bp的3＇-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

莲藕多酚氧化酶基因(PPO)的克隆与表达分析

为获得莲藕中多酚氧化酶(Ppo)基因序列信息及其表达情况,运用PACE技术从莲藕(Nelumbonucifera Gaertn.ssp.nucifera)茎尖中克隆到多酚氧化酶基因全长序列,其cDNA全长2 074 bp,完整的编码框为1 503 bp,编码501个氨基酸,5’端有160 bp非编码区,3’端有411bp非编码区(GenBank登陆号为HQ380894).采用生物信息学方法发现该蛋白分子量约为56.8 kD,pI为8.60,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白,a-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中.半定量RT-PCR结果显示,该基因在莲藕茎尖、幼叶、莲藕鲜切片、花瓣、茎杆5种组织中均有表达.方差分析表明,茎尖中PPO表达量与幼叶差异不显著,但显著高于其余三个部位;幼叶中表达量与莲藕鲜切片之间差异不显著,但显著高于花瓣和茎杆;花瓣和茎杆中PPO表达量最低,两者无显著差异.上述结果说明作为重要分生组织的莲藕茎尖产生的PPO可能不具活性或极不稳定,随着植株的生长发育被分配到各组织中,在特定时空下被激活并担负相应的职责功能.     

马铃薯腐烂茎线虫类毒液过敏原蛋白基因(Dd-vap-1)的克隆与表达定位分析

植物寄生线虫食道腺分泌蛋白在寄生致病过程中起到至关重要的作用.用RT-PCR结合RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)中克隆了一个类毒液过敏原蛋白新基因Dd-vap-1.Dd-vap-1 cDNA全长1346bp,开放阅读框的长度为l 209 bp,推导编码一个含有402个氨基酸的蛋白序列(GenBank登录号JQ341057).推导蛋白Dd-VAP-1预测分子量为45.3 kD,等电点为6.68,序列比对分析表明,Dd-VAP-1为富含半胱氨酸分泌蛋白家族成员.原位杂交结果显示,Dd-vap-1在马铃薯腐烂茎线虫的亚腹食道腺细胞特异表达,推测该基因在马铃薯腐烂茎线虫侵染甘薯的早期阶段起重要的作用.     

草莓半胱氨酸蛋白酶基因(FaCP)的克隆及表达分析

半胱氨酸蛋白酶作为一种重要的水解蛋白酶,参与植物的许多生理过程.采用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria×ananassa)中克隆到半胱氨酸蛋白酶基因FaCP (GenBank登录号:JN979371),该基因cDNA全长1 338 bp,包含一个1 062 bp完整的开放阅读框(ORF),编码354氨基酸.生物信息学序列分析表明,FaCP开放阅读框编码的氨基酸序列与其他植物的CP蛋白同源性较高.Real-time PCR分析发现,FaCP基因在草莓果实、叶、根、茎和花萼中都有表达;在果实成熟过程中FaCP表达量逐渐增加,在粉红果最高,红果中略有下降.在草莓叶片中,随着叶片衰老,FaCP基因表达量增加明显.研究结果表明,FaCP可能参与了调控草莓果实的成熟及叶片衰老.     

桃果实铜锌超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD的克隆与分析

从已构建的硬肉桃(Prunus persica L.)双久红果实SSH文库中获得4条铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因的ESTs,通过blast比对和电子克隆后进行了序列拼接和经RT-PCR方法,获得桃果实铜锌超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD全长cDNA序列(GenBank登录号:JX217743).该基因全长665bp,包含一个459bp的ORF(120bp-578bp),编码152个氨基酸,推测蛋白分子量为15.38kDa,理论等电点为5.60.该基因具有典型的高度保守的Cu2+和Zn2+活化中心及特征信号,其氨基酸序列与其他植物的CuZnSOD具有很高的相似性.生物信息学分析结果表明,该蛋白定位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白.二级结构分析结果表明,该蛋白主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,三维结构预测结果显示,PpCuZnSOD有3个转角环和8个折叠构成桶状的活性中心.系统进化分析结果表明PpCuZnSOD与小金海棠(Malus xiaojinensis)sod2同源关系最近,而与荔枝(Lichi chinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)和拟南芥(Arabidopsis trifoliate)等亲缘关系较远.QPCR结果表明,PpCuZnSOD在幼果中表达量最高,雌蕊和雄蕊次之,花瓣和叶片中表达量最少;果实成熟前后,PpCuZnSOD在硬肉芽变桃双久红果实中的表达量显著高于软肉桃川中岛白桃中的表达量,表明该基因可能在维持果实质地和硬度方面有一定作用.本研究结果为进一步研究该基因在桃果实成熟软化中的作用奠定了基础.     

甘蔗富含甘氨酸蛋白基因(Sc-GRP)的克隆及其表达分析

本研究在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,通过EST (expressedsequence tag)序列测定和生物信息学分析,获得了1个编码富含甘氨酸蛋白(glycine-rich protein,GRP)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-GRP.生物信息学分析表明,该基因全长518bp,包含一个273bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),5'端非编码区(untranslated region,UTR)长58bp,3’端UTR长187bp,且在3’端UTR中有典型的加尾信号AATAAA和polyA结构.该基因编码长度为90个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10.12kD,等电点为5.86.Sc-GRP中甘氨酸含量最高,达到13％,且包含明显的GGX和GX重复结构单元.Sc-GRP没有信号肽和RNA结合位点.定量PCR分析结果表明,该基因在成熟叶片中的表达量远高于其在心叶中的表达量.在甘蔗茎中,随着节间成熟度的增加,其表达量逐渐升高,但在成熟根中几乎没有表达.在铝盐胁迫下,该基因在甘蔗初生根中的表达先是升高,然后随胁迫时间的增加而下降.研究结果提示该基因定位于细胞质,参与细胞的渗透调节,本研究结果为该基因的功能解析及其在甘蔗分子育种上的应用积累了基础资料.     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定

根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。     

黄瓜AP1-FUL类MADS-box基因的克隆及表达分析

MADS-box基因在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。利用生物信息学方法,获得黄瓜AP1-FUL类CsMADSs基因;半定量RT-PCR检测CsMADSs在黄瓜不同生长发育阶段及不同器官中的表达情况。结果表明,本研究克隆得到三个CsMADSs基因,长度分别为636bp、747和648bp。CsMADS08和CsMADS10在黄瓜不同时期的不同器官中均能表达,其中,CsMADS08在茎和叶中的表达量较高,而CsMADS10在顶芽中表达量较高;CsMADS21基因除了在1叶和5叶期的各器官中都能表达外,在其他器官只是部分表达,且表达量都比较低。另外,CsMADS08和CsMADS10几乎在7叶期黄瓜的所有器官中都表达,而CsMADS21只在少数器官中表达,以幼果中表达量较高,而在根、茎及较大的卷须中都不表达。该研究结果不仅能够明确黄瓜CsMADSs基因的时空表达模式,而且为进一步研究CsMADSs基因的功能提供理论依据。     

黑果枸杞WD40编码基因LrAN11的克隆及表达分析

WD40蛋白广泛存在于真核生物中,是一类高度保守的蛋白家族,具有广泛的生物化学和细胞生物学功能。为探索黑果枸杞LrAN11的功能,采用同源克隆的方法克隆了黑果枸杞WD40蛋白基因,将其命名为LrAN11,Gen Bank登录号:KY131959。生物信息学分析结果表明,该基因的编码区长1 029bp,编码342个氨基酸,蛋白分子量为38.3 kD,理论等电点为4.95,含有5个WD40基序,属于WD40类蛋白基因家族;经预测LrAN11定位于细胞质中,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与马铃薯、番茄、甜椒和美花烟草具有较近的亲缘关系;定量RT-PCR检测表明,LrAN11基因在黑果枸杞各组织中均有表达,其中在青果中的相对表达量最高,在根和紫果中次之,而在黑果中表达最低,表明LrAN11可能参与黑果枸杞花青素的生物合成的调控;在韩国枸杞和0901枸杞品种中表达显著,在其他14个枸杞品种中表达均较低且无显著差异性(P0.05),说明LrAN11的表达具有品种特异性。此外,随着NaCl处理时间的延长,该基因的表达量先降低后升高,且在2、12和24 h的表达量与对照相比存在显著差异性(P0.05),说明LrAN11可能参与黑果枸杞对盐胁迫的响应。本研究结果为进一步阐明黑果枸杞LrAN11基因的功能及其在黑果枸杞遗传改良中的应用奠定了基础。     

胡枝子高质量RNA的提取及ALMT基因片段的克隆和表达分析

针对木本植物胡枝子组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,采用改良的CTAB法,成功地从胡枝子组织中提取了总RNA。所提取的胡枝子总RNA OD260/OD280值介于1.9~2.1之间,产率介于100~250μg/g之间。采用该方法提取的胡枝子总RNA,经过RT-PCR成功地克隆到了胡枝子ALMT基因片段,克隆得到的胡枝子ALMT基因片段序列与已知ALMT基因序列之间具有较高同源性,经半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR表达分析,证明该基因在根中表达且受铝诱导。试验结果表明利用改良的CTAB法提取的胡枝子总RNA样品质量较高,能够用于基因的半定量和定量表达分析。     

甘蓝型油菜中黑芥子酶基因在大肠杆菌中重组质粒的构建和表达

实验通过RT-PCR程序从提取的油菜总RNA中扩增出硫代葡萄糖苷水解酶（又称黑芥子酶,EC3.2.1.147）基因,酶解后插入大肠杆菌表达载体（Escherichia coli）pGEX-4T-1,获得克隆菌株。基因测序在 GenBank中的登陆号为EF583560,翻译的氨基酸序列与已报道的黑芥子酶（GenBank中的登陆号为Q00326）中的一段有一个氨基酸不同,同源性达到99%。经过IPTG诱导表达,在91KDa左右处有表达量很高的一条带。     

Vacuolar invertases in sweet potato: molecular cloning, characterization, and analysis of gene expression

Two cDNAs (Ib beta fruct2 and Ib beta fruct3) encoding vacuolar invertases were cloned from sweet potato leaves, expressed in Pichia pastoris, and the recombinant proteins were purified by ammonium sulfate fractionation and chromatography on Ni-NTA agarose. The deduced amino acid sequences encoded by the cDNAs contained characteristic conserved elements of vacuolar invertases, including the sequence R[G/A/P]xxxGVS[E/D/M]K[S/T/A/R], located in the prepeptide region, Wxxx[M/I/V]LxWQ, located around the starting site of the mature protein, and an intact beta-fructosidase motif. The pH optimum, the substrate specificity, and the apparent K(m) values for sucrose exhibited by the recombinant proteins were similar to those of vacuolar invertases purified from sweet potato leaves and cell suspensions, thus confirming that the proteins encoded by Ib beta fruct2 and Ib beta fruct3 are vacuolar invertases. Moreover, northern analysis revealed that the expression of the two genes was differentially regulated. With the exception of mature leaves and sprouting storage roots, Ib beta fruct2 mRNA is widely expressed among the tissues of the sweet potato and is more abundant in young sink tissues. By contrast, Ib beta fruct3 mRNA was only detected in shoots and in young and mature leaves. It appears, therefore, that these two vacuolar invertases play different physiological roles during the development of the sweet potato plant.     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

本研究利用RT-PCR从马铃薯（Solanum tuberosum）茎段总RNA中扩增、克隆了一cDNA分子。该cDNA分子含有一长为1224bp的开放读框,可编码一含407个氨基酸残基的多肽、理论分子量为46.40kD、可能为亲水性的胞外酶。因其氨基酸序列同源于α-淀粉酶,故将该基因命名为amyA1（NCBI收录号：GQ406048.1）。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了amyA1密码子的偏好性,以期为选择适宜的表达系统提供依据;同时对amyA1的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行了预测。基于NCBI数据库中有物种代表性的29种α-淀粉酶基因序列构建了基因进化树。与NCBI收录的马铃薯α-淀粉酶基因（NCBI收录号：M79328.1）的核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20至第348范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域（PF00128、SM00624）,第349至第407范围内的氨基酸残基含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域（PF07821）。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的（β/α）8桶状结构以及其它几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,2个马铃薯α-淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦和玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用

以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。     

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化

为了降低烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和马铃薯Y病毒（potato irus Y,PVY）复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV—CP和PVY—CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300—35S—OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功。并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草。     

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA在烟草中的表达及其酶活性

摘要：将马铃薯(Solanum tuberosum )块茎特异蛋白patatin classⅠ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合，构建了植物表达载体pBSSP。用电激法将表达载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后转化烟草(Nicotiana tabacum )叶片获得再生植株。经PCR、PCR-Southern、Northern杂交和蛋白质检测，证明patatin classⅠ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。酯酰水解酶（lipid acylhydrolase, LAH）活性分析显示，转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高。     

芹菜水孔蛋白基因AgPIP2;1的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了研究芹菜质膜内在蛋白基因的序列特征及其在非生物胁迫条件下的表达特性,探讨其抗逆功能,以芹菜品种六合黄心芹为试验材料,通过RT-PCR技术克隆AgPIP2;1基因,通过生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,并采用荧光定量PCR技术检测其在不同组织的表达及其对非生物胁迫的响应。结果表明,AgPIP2;1基因含有1个861 bp的开放阅读框,编码286个氨基酸,其编码的蛋白属于PIP2类蛋白。氨基酸序列分析显示,AgPIP2;1含有高度保守的NPA基序以及高等植物PIP蛋白的保守序列,与其他物种PIP2类蛋白具有较高的同源性,与胡萝卜DcPIP2;1的氨基酸序列同源性达到97.90%。在亲缘关系上与大豆GmPIP2;1、胡萝卜DcPIP2;1和绿豆VrPIP2;1较为接近。实时荧光定量PCR技术分析表明,AgPIP2;1基因在芹菜根、叶柄和叶片中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,在根中的表达量最低,呈现比较明显的组织特异性。此外,AgPIP2;1基因受到高温、低温、干旱和盐等非生物胁迫的诱导,说明该基因可能参与芹菜抵御非生物胁迫的过程。本研究为进一步了解AgPIP2;1基因的功能及其在非生物胁迫中的作用奠定了基础。     

烟草扭脉病毒部分基因组特征及其分类地位分析

通过RT-PCR从烟草丛顶病发病烟株总RNA中获得烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）基因组部分序列。序列分析显示该片段全长1655bp,共包含TVDV的部分RdRp基因、完整的CP基因和完整的MP基因。其中RdRp基因与CP基因的间隔区（IR）长201nts,符合马铃薯卷叶病毒属病毒的归属依据;对RdRp、CP、MP基因以及IR序列的对比分析,显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的较高同源性。根据三个ORF编码的氨基酸序列构建的分子同源树的分析,也都显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的同源性最高,进一步证实了TVDV应该是黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的确定成员。