马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒（PVY）在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白（CP）基因为模板扩增300bp和354bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与wyCP同源的hairpin RNA。结果表明,瞬时表达的hairpin RNA有效干涉了PVY侵染。     

瞬时表达比较2种不同的RNAi载体的干涉效果

 RNAi with natural defence mechanism of homologous RNA degradation is widely used in research of antiviral plant. It is important to construct a highly efficent RNAi vector for transgenic plants of virus resis-tance. In this study, part fragments of coat protein gene of Potato virus Y (PVY) (451-750 bp) were inserted into the two expression vectors. Vector pROKY300 without intron and pHelY300 with PDK and CAT introns on the hpRNA stem were constructed. The silence efficiency of virus resistance of the two vectors was investigated as 88% (22/25)for pROKY300 and 92% (23/25) for pHelY300 through transient expression mediated by agroinfiltration. The results showed that both vectors were highly antiviral and elucidated the validity of RNAi-medicates resistance to virus.     

贵州马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆与遗传分析

本研究从中国贵州不同海拔地区采集感染马铃薯Y病毒(PVY)病害叶片,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)方法克隆到长度为804 bp的8个目的片段,序列分析表明为PVY外壳蛋白(PVY-CP)基因.通过与已经发表的PVY-CP基因序列进行比较和遗传分析,并根据PVY的CP基因全长和5'端序列构建系统发育树,结果表明,本研究分离的PVY,7株为O株系,1株为NTN株系.     

农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用

农杆菌渗入法是在植物中瞬时表达外源基因的一种方法,该方法通过在植物叶片上注射农杆菌,使目的基因转入植物细胞中进行快速表达。本文综述了农杆菌渗入法的原理、技术流程、影响因素及其应用,其应用主要涉及外源基因的表达、检测转基因的表达、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、细胞定位以及基因相互作用等方面。随着技术的进一步完善,我们相信该技术将成为转基因育种领域的重要的手段。     

TC-RT-PCR技术在马铃薯病毒检测及其基因克隆上的应用

利用试管捕捉RT—PCR（TC—RT—PCR）技术从马铃薯病毒发病叶片中检测并克隆到PVX、PVY和PLRV3种病毒及其外壳蛋白基因的全长序列,长度分别为714、804和627bp。结果表明,TC-RT—PCR技术是一种简单,快捷,灵敏度高的方法,在马铃薯病毒的检测和相关基因的克隆中将会得到很好的应用。