离体筛选花生抗逆突变体及其后代特征特性研究

在课题组前期研究确立的花生体胚诱导及高频率植株再生体系和确立的适宜平阳霉素(PYM)诱变浓度基础上,进行花生离体诱变及定向筛选抗逆突变体研究。以花生品种花育20号成熟种子胚小叶为诱变材料,在含3mg/L PYM的诱导培养基上培养4周进行诱变处理。以羟脯氨酸(HYP)作为筛选压力添加于培养基中,确定体胚萌发阶段培养基中添加4mg/L HYP,以及体胚萌发后添加8mg/L HYP为适宜浓度的筛选方法。2011年将获得的HYP耐性苗经嫁接移栽田间,成熟后13株耐性嫁接苗获得种子。2012年将13个单株的部分种子分别播种于田间,生长发育阶段观察发现,12个耐性植株后代在株高、茎枝颜色、株型、开花习性等方面与诱变亲本不同,明显表现出变异,并且大部分植株后代性状发生分离。13个耐性单株中的7个单株收获的其他种子分别播种于塑料大棚,苗期进行干旱处理后,大部分植株生长正常,而诱变亲本的生长明显受到抑制;取干旱处理后的叶片测定POD活性和SOD活性,结果显示,这7个耐性单株中的5个单株后代SOD活性高于亲本,这5个单株后代中的4个POD活性也高于亲本。     

平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响

本文对花生离体培养高频率体细胞胚(体胚)诱导方法,及平阳霉素(PYM)对体胚发生的抑制作用进行了研究,旨在为以PYM作为化学诱变剂进行花生离体诱变提供有效方法.以花生品种花育20号和花育22号成熟种子的胚小叶为外植体,在添加不同浓度2,4-D(0,5,10,15,20mg/L)的MSB5(MS无机盐+B5有机成分)培养...     

糯玉米离体培养获取耐盐变异体

为了获取糯玉米耐盐变异体,以120mg/L的平阳霉素预处理糯玉米自交系（S1、S2）种子20h,萌发后用茎尖诱导胚性愈伤组织,比较了激素组合对胚性愈伤组织诱导、继代和分化的影响。结果表明2, 4-D 2.0mg/L和6-BA 0.25mg/L组合诱导胚性愈伤的效果最好;在添加100mg/L CH、6-BA 0.25mg/L和2, 4-D 2.0mg/L的继代培养基上愈伤组织生长良好。将胚性愈伤组织依次在含NaCl 10g/L、15g/L和20g/L培养基中进行筛选,获得耐盐变异体,转入分化培养基中诱导再生植株,自交1代种子在含NaCl 15g/L、20g/L的培养基上萌发率较对照种子高数倍,在20g/L NaCl的胁迫下,变异体自交1代种子幼苗叶片中脯氨酸含量及K+ / Na+比例明显高于对照。     

高能混合粒子场辐照对花生胚小叶组织培养及植株再生的影响

采用不同剂量的高能混合粒子场(0、67、105、150和196Gy)辐照花生鲁花11号干种子,取其胚小叶外植体,先后置于添加10mg/L 2,4-D的MSB5诱导培养基和添加4mg/L BAP的MSB5培养基上进行培养,研究了不同剂量辐照对外植体存活率、体胚诱导率和植株再生率的影响。结果表明:外植体存活率,除67Gy辐照组和对照无显著差异外,其他处理随辐照剂量的增大而显著下降;体胚诱导率,辐照剂量为67Gy时和对照无显著差异,当辐照剂量分别增加至105Gy和150Gy时,其体胚诱导率显著低于67Gy时的体胚诱导率,而二者之间无显著差异,当辐照剂量再增加至196Gy时,未观察到体胚的形成;植株再生率,除105Gy和150Gy剂量时无显著差异外,其他处理随辐照剂量的增大而显著下降。在辐照剂量为105Gy时,外植体存活率、体胚诱导率和植株再生率均约为对照的一半,因此推断105Gy可作为鲁花11号适宜的诱变剂量。再生苗嫁接后移栽于试验田正常结实。     

甘薯耐旱、耐盐突变体的离体筛选

以甘薯品种“栗子香”的胚性悬浮细胞为材料，用PEG6000和NaCl分别作为耐旱性和耐盐性选择剂，对甘薯耐旱、耐盐突变体离体筛选的适宜选择压和筛选方法进行研究。（1）将“栗子香”的胚性悬浮细胞分别培养在含有0-35%PEG和2.0mg/L2,4-D的MS液体培养基中，结果表明，30%PEG为甘薯耐旱性离体筛选的适宜选择压，采用多步选择法和离体重复筛选，由经过γ-射线80Gy照射的900个“栗子香”胚性细胞团筛选得到17个抗性愈伤组织，其中16个再生出植株，（2）将“栗子香”的胚性悬浮细胞培养在含有0-3.0%NaCl和2.0mg/L,2,4-D的MS液体培养基中，结果表明，2.0%NaCl适合甘薯耐盐性离体筛选。采用多步选择法，由900个辐照后的胚性细胞团获得22个抗性愈伤组织，其中20个再生出植株，初步离体鉴定结果表明，这些再生植株比对照表现出较强的NaCl耐受性。     

甘薯离体诱变与抗盐突变体鉴定

为了获得甘薯抗盐突变体材料，本研究以平阳霉素(PYM)为诱变剂处理徐薯18的茎段获得甘薯突变体植株，并在NaCI培养基中筛选抗盐突变株系。结果表明，1.00 mg·L^-1 PYM为徐薯18茎段诱变处理14 d后的半致死浓度。将徐薯18茎段接种至含不同浓度NaCl的MS培养基，结果表明125 mmol·L^-1NaCl为抗盐突变体的筛选浓度。最后，将经1.00 mg·L^-1 PYM处理14 d后的甘薯植株的茎段接种到含125 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基，通过生根率筛选抗盐植株。盐胁迫下生根率最高的3株诱变植株的根长、株高、根鲜重、地上部鲜重、总鲜重、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量等指标的测定结果表明，这3株诱变植株的各形态和生理指标均显著优于诱变亲本徐薯18。隶属函数分析结果表明，这3株诱变植株的抗盐性均显著高于诱变亲本。与诱变亲本徐薯18相比，盐胁迫下3株突变体中的抗盐相关基因IbSOD、IbPOD、IbAPX和IbSOS的表...     

水稻耐盐碱突变体再生后代遗传变异的研究

本文报道了经盐碱筛选的水稻再生植株生长发育及再生植株后代生理指标的改变。明确经盐碱筛选后再生的植株在株高、生育期、分蘖数、分蘖数、分蘖数、空瘪率等多项农艺性状上发生变异，且可在后代中遗传。     

利用青花菜单倍体茎尖筛选耐热变异体

用平阳霉素对青花菜“上海4号”和“东村交配”的单倍体茎尖进行诱变处理,以高温作为选择压力,获得一批耐热性明显比原始品种提高的单倍体变异体。经过染色体加倍后,通过热胁迫条件下电导率的测定,筛选出9份细胞膜热稳定性比原始品种明显提高的变异体材料。     

中华猕猴桃耐盐变异体筛选

取中华猕猴桃(Actinidia chinensis)101品系试管苗叶片为外植体,诱导愈伤组织,将愈伤组织移入含NaCl的MS培养基选择8次,培养基内NaCl的浓度逐步增加,γ射线作为诱变剂,已筛选出耐0.5％、0.7％、1.0％NaCl的变异细胞系,并均再生出完整植株。试验结果表明:1.MS+0.5ppm 2,4-D+1.0ppm Zt是最佳的脱分化培养基;MS+1.0ppm Zt+0.2ppm IBA是最佳的分化培养基;生根培养基可采用MS+0.5ppm IBA。2.0.5％NaCl可作为耐盐筛选的盐分临界值。3.γ射线处理对愈伤组织的生长及细胞的大小均有显著的影响,5kR可作为变异体筛选的诱变照射量。     

利用油菜单倍体茎尖筛选抗菌核病变异体

用平阳霉素 (Pingyangmycin)对甘蓝型油菜品系 9885和 9841的单倍体茎尖进行诱变处理 ,以草酸作为选择压力 ,获得一批耐草酸性明显比原始品种提高的变异体。经大田抗菌核病性鉴定 ,筛选出 3份抗病性比耐病品种显著提高的种质材料     

甘蓝类植物小孢子培养及植株再生研究

对3个甘蓝类植物(甘蓝、青花菜、羽衣甘蓝)19个品种小孢子胚胎发生和植株再生的影响因素进行了研究,结果表明,基因型不仅影响供试材料的小孢子胚状体发生频率,也影响胚状体的质量;4℃低温预处理0 ～2d结合32.5℃热激1d,能显著提高供试基因型小孢子出胚率.胚状体先在NLN-13液体培养基中培养25d,有利于胚状体分化成苗;后在B5固体分化培养基中添加1％ ～1.2％琼脂,可有效促进胚状体萌发和植株再生.小孢子再生植株先使用流式细胞仪在生长初期鉴定倍性,后对单倍体植株采用200mg·L-1秋水仙碱浸根处理20h,并用流式细胞仪鉴定,此方法可快速、有效地获得双单倍体植株.     

诱变与组织培养相结合诱发水稻耐盐突变的初步研究

以4个水稻品种的成熟种子作为外植体,用γ射线、叠氮化钠(SA)施行单项或复合诱变处理后进行组织培养,出愈后的部分愈伤组织再用γ射线辐照处理,并在含NaCl的筛选培养基上进行耐盐突变的筛选。结果表明,15kRγ射线对出愈率和生长率均有严重的抑制作用,而1mMSA单独处理对出愈率和生长率则有促进作用,所有诱变处理都降低了植株分化频率,愈伤组织的生长速率和植株再生率虽随筛选培养基中NaCl含量的提高而下降,但1％NaCl作为耐盐突变体的筛选压较为适宜。诱变处理的种子愈伤组织再以适当剂量的γ射线辐照,有提高诱发耐盐突变频率的作用。适宜的照射量为500—750R。     

小白菜耐盐变异体的诱导及离体筛选

以3份优良小白菜品种为供试材料,研究了培养基中不同NaCl浓度对种子萌发和茎端组织存活及生长的影响;不同平阳霉素浓度及时间的处理对种子萌发和茎端组织存活及生长的影响。结果表明：供试种子的萌发率和茎端组织的存活率随培养基中NaCl浓度的上升急剧下降,平阳霉素处理对茎端组织存活率的抑制明显大于对种子萌发率的影响,平阳霉素处理后存活的种子和茎端组织经NaCl胁迫筛选,筛选出耐NaCl胁迫力明显提高的存活苗,存活苗经无性繁殖,可以保持较高的耐NaCl能力。     

花生转化和再生研究进展

90年代以来,随着花生遗传转化和再生技术的进步，美国已分别获得抗病和抗虫转基因花生，取得突破性进展。目前，成功的农杆菌介导遗传转化以花生幼苗嫩叶、子叶为外植体，通过卡那霉素筛选，器官发生再生转化植株；基因枪介导的遗传转化是以胚愈伤为转化材料，通过潮霉素筛选转化体胚，再生转化植株。     

利用小孢子胚离体培养筛选抗除草剂的油菜

选用4个甘蓝型油菜（Brassica napus L．）F、（7039，7040，282和5102）为小孢子培养供体材料，分别对小孢子胚在含草甘膦和盖草能的培养基上进行培养，以筛选出抗草甘膦和抗盖草能的胚状体，进而获得再生植株。其中，基因型7039和7040用于草甘膦筛选，282和5102用于盖草能的筛选。选取子叶期胚状体，在含0．006％的草甘膦及0．01％和0．02％盖草能的MS-2培养基上培养2周，不抗草甘膦和小抗盖草能的胚状体2周内变褐死去，抗草甘膦和抗盖草能的胚状体转绿。随后转绿胚状体转移至正常MS-2培养基中继续培养，直至获得再生植株。再生植株喷施0．25％的草甘膦液表明均抗草甘膦；而对植株喷施0．05％的盖草能液时，0．02％筛选出的植株大部分为抗盖草能，而0．01％筛选出的植株却大部分死去，表明用0．02％浓度筛选抗盖草能植株的方法更有效。用170mg／L秋水仙碱直接处理再生植株20和30h，染色体加倍率分别达到了34％和52％。     

以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化

用木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt),构建了植物表达载体pCAMBIA1301-xylA。再利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生,转移到添加蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5,10,20,30g/L)的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养。对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计,结果表明,当木糖浓度为10g/L时,诱导成苗率为15.25%,再生植株生长健壮,且转基因阳性率高达77.27%,最终确定10g/L为最适木糖筛选浓度。该筛选方法利用木糖作为筛选剂,可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患,转化效率高,是一种安全、高效的筛选方法。     

农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化

以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。     

百合农杆菌介导的遗传转化受体系统的建立

以麝香百合"素雅"(white-Elegance)作为供试材料建立了百合农杆菌介导的受体系统。鳞茎片的诱导分化以MS培养基中添加0.5mg/L6-BA 0.2mg/LNAA为最好;再生苗鳞茎片的不定芽分化以MS培养基中添加1.0mg/L6-BA 0.2mg/LNAA为最好;再生苗小叶柄的诱导以MS培养基中添加1mg/LNAA为佳。确定了再生苗不同部位适宜的抗生素筛选浓度,卡那霉素的筛选浓度小鳞茎块确定为125mg/L,而小叶柄确定为75mg/L;头孢霉素抑菌浓度确定为250mg/L。     

忽地笑体细胞无性系变异的ISSR分析

以外植体母株为对照,利用ISSR标记对来自同一忽地笑鳞茎诱导,通过不定芽和体胚发生途径形成的再生一代和二代植株的体细胞无性系变异进行了分析。结果表明,再生植株出现不同程度的ISSR位点变异,表现为新增加带和缺失带。体胚发生途径出现的ISSR位点变异率高于不定芽形成途径。第二世代的变异率高于第一世代。体胚发生途径形成的第...     

日本臭菘体细胞胚胎发生及植株再生体系的建立

以日本臭菘幼叶为外植体,应用均匀设计法筛选其最适合的胚性愈伤组织及胚性细胞复合体诱导、体细胞胚胎发育及植株再生的培养基配方,建立日本臭菘体细胞胚胎发生体系。结果表明,LS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L适宜日本臭菘幼叶胚性愈伤组织及胚性细胞复合体诱导,诱导率为98%;LS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+IAA 0.10 mg/L最适宜体胚发育及植株再生,体胚萌发率为100%,萌发的体胚在发育培养基上继续培养42 d后全部发育成完整植株。对不同阶段培养材料的形态结构及超微结构的观察证明,成功建立了日本臭菘体细胞发生及植株再生体系。