甘蔗根癌农杆菌介导遗传转化研究

以根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens)EHA105菌株介导将海藻糖合酶基因（TSase)遗传转化甘蔗（Saccharum officinarum)胚性愈伤组织，对转化材料进行连续的PPT抗性筛选。获得93株抗性植株。对部分植株的总DNA作PCR及Dot-Southern检测。结果3株呈阳性，而对照均为阴性，证明外源基因已整合到甘蔗基因组中。     

以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化

用木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt),构建了植物表达载体pCAMBIA1301-xylA。再利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生,转移到添加蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5,10,20,30g/L)的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养。对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计,结果表明,当木糖浓度为10g/L时,诱导成苗率为15.25%,再生植株生长健壮,且转基因阳性率高达77.27%,最终确定10g/L为最适木糖筛选浓度。该筛选方法利用木糖作为筛选剂,可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患,转化效率高,是一种安全、高效的筛选方法。     

农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化

以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。     

CHI-PAT双价基因遗传转化贵州禾来拢

以贵州禾来拢幼胚为转化受体,用农杆菌介导法将几丁质酶和抗除草剂抗性双价基因（CHI-PAT）导入来拢幼胚,筛选出抗性愈伤组织并获得抗性植株.抗性植株经GUS组织化学及PCR检测呈阳性,转基因植株对50 mg/L的Basta溶液有抗性.初步证明CHI和PAT基因已整合进了水稻基因组中.     

农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究

采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。     

高赖氨到基因导入玉米自交系的研究

通过对18个玉米自交系的组织培养，筛选到8个可以正常分化的自交系。用基因枪的方法对其中的4个自交系进行了遗传转化，将高赖氨酸基因导入玉米的胚性愈伤组织，以减少潮霉素筛选次数和筛选浓度的方法，得到分化再生植株，经分子检测，证明外源基因已成功整合到玉米基因组中。部分T0代植株正常结实，通过对T1代植株的分子检测，表明外源基因可以稳定遗传，对其中的转化植株所结的种子进行了赖氨酸含量的检测，发现赖氨酸含量最高提高了16％。     

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。     

农杆菌介导高粱成熟胚遗传转化获得耐草甘膦植株

利用萌动的成熟胚作外植体进行基因转化,可有效提高高粱转基因材料选育的效率。为了建立并完善以高粱萌动种胚作为外植体的遗传转化体系,本研究以高粱材料Is-623为转化受体,质粒pM3301UbiSpCP4为外源基因供体,采用农杆菌介导法进行遗传转化,并对转化的关键因素进行分析。结果表明,麦草畏(dicamba)诱导高粱萌动的成熟胚产生愈伤组织适宜浓度约为5 mg·L^-1;农杆菌侵染时间为2 h时遗传转化效率较高;经筛选共获得301块抗性愈伤组织,75个转化事件,经PCR、Southern blotting杂交分析、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条检测及田间草甘膦耐性鉴定,最终获得草甘膦耐性等级1级株系6株,耐性等级2级株系3株的转基因高粱株系。本研究初步建立了以高粱萌动种胚作为外植体的遗传转化体系,为高粱遗传转化体系的研究和应用奠定了基础。     

农杆菌介导的水稻双基因共转化初步研究

利用农杆菌介导法将分别位于不同质粒上的gus基因和nptⅡ基因按照1︰1和1︰3的浸染浓度混合共转化粳稻品种鄂宜105和中花12种子胚诱导的愈伤组织,结果从43棵经潮霉素反复筛选的再生植株中获得21棵共转化植株。经PCR分析表明2个基因的共转化率分别为47.37%和60.00%。Southern Blot和Western Blot检测发现gus基因已经整合到水稻基因组中并且表达。遗传分析证实外源基因在T1中大多以孟德尔方式进行遗传。分析了影响转化率的几个因素如浸染菌量比例和品种之间的关系以期进一步提高共转化的效率。     

根癌农杆菌介导苜蓿遗传转化体系的建立

以建立的苜蓿高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法，研究了影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens Conn)LBA4404菌株介导的苜蓿（Medicago sativa L)遗传转化的若干因素，建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系，获得了转BADH基因植株。苜蓿的不同基因型、附加乙酰丁香酮的浓度、预培养与否、菌液浓度、共培养时间和卡那霉素浓度等对转化频率都有一定影响。最高转化频率可达43.3％，抗性植株经PCR和PCR-Southern blot检测表明，目的基因已整合进苜蓿基因组中。