肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白的表达及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因,并定向克隆到pET-32α( )中,转化宿主菌(E.coli)BL21(DE3)。重组菌经1mmolLIPTG诱导,在30℃下,5h时表达产物(分子量约为37kD)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中,经Westernblot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种实验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠,对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因，并定向克隆到pET32a(+)中，转化宿主菌BL21（DE3）。重组菌经1mM IPTG诱导，在30℃下，5h时表达产物（分子量约为37KD）达到高峰，表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中，经Western blot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种试验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠，对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因(ahyR)突变株的构建及特性分析

根据GenBank公布的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)转录调控蛋白基因ahyR序列设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR的部分片段。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kanr)基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化嗜水气单胞菌J-1株感受态细胞,获得1突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因同源突变株,命名为J-1△ahyR。与J-1株相比,突变株的外膜蛋白图谱和部分生化特性发生改变;胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子同时丧失;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×108CFU(colonyformingunits)。该研究为ahyR基因功能的探讨及嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。     

表达猪源链球菌类M-MRP融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

利用PCR技术,分别扩增马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)ATCC35246株类Mszp基因583￣1063位碱基和猪链球菌(S.suis)2型HA9801株mrp基因298￣827位碱基的片段。通过在类M基因片段的3!端和mrp基因片段的5!端引物添加共同的SacⅠ酶切位点,利用T4连接酶连接,克隆至pET-32a( )载体。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,经IPTG诱导,可获得分子量约为60kD的融合蛋白。通过MRP和类M蛋白的多克隆抗体进行ELISA反应和免疫印迹分析表明:表达的融合蛋白同时具有类M蛋白和MRP的抗原性。用组氨酸亲和层析柱纯化的重组融合蛋白,和链球菌的全菌二联灭活疫苗分别免疫两组仔猪,重组蛋白的免疫保护率达60"。     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。     

中国野生葡萄芪合成酶基因融合表达、纯化及多克隆抗体制备

根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列(该序列已申请国家发明专利,申请号:200510041662.4),设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)白河-35-15'RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化EscherichiacoliBL21,经诱导后表达出约66kD的融合蛋白。该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与GlutathioneSepharose4BFastFlow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白。以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Westernblot检测,该抗血清(稀释到1∶3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。     

姬松茸多糖提取工艺的优化

对姬松茸子实体多糖提取的工艺条件中的多糖提取温度、提取时间、浸提液pH值3因子的最优化组合问题进行了定量研究,建立了具有良好预测性能的姬松茸多糖提取条件的模型,并利用回归模型对工艺条件的最优化组合,对各单因子要素的多糖得率及其交互作用进行了探讨。试验表明,当浸提温度为100℃、浸提时间为3h、浸提液pH值为6.3时多糖得率处于较高水平     

植物恢复措施对鸡西矿区废弃地土壤养分的影响

以黑龙江省鸡西市矿区废弃地为研究区,对不同矿区废弃地的土壤养分元素进行含量分析。结果表明：应用植物恢复措施后的基质土壤各养分指标绝大多数要大大高于原废弃地土壤和经过自然恢复的土壤,说明该措施对石墨尾矿、矸石发电厂粉煤灰废弃地和平排矸石山土壤养分改善效果明显;其中石墨尾矿除全磷外,各种养分指标与林地土壤差距较大,而旱柳对石墨尾矿土壤的改善效果最好,其有机质含量为37．28g／kg,是残渣的2．6倍;种植大果沙棘对粉煤灰废弃地土壤养分的积累效果明显,有机质含量为48．25g／kg,是残渣的1．5倍;植物恢复措施使平排矸石山的土壤养分积累速度加快,已接近林地,混交种植兴安落叶松和家榆总体恢复效果最好,有机质含量分别为193．42和151．46g／kg,是自然恢复条件下的8．9和7倍。建议引入优势种群（如松科等）以加快演替速度,使矿区废弃地更快地恢复到原始状态。     

Towards bioremediation of toxic unresolved complex mixtures of hydrocarbons: identification of bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins

Background, aim and scope  Unresolved complex mixtures (UCMs) of aromatic hydrocarbons are widespread, but often overlooked, environmental contaminants. Since UCMs are generally rather resistant to bacterial degradation, bioremediation of UCM-contaminated sites by bacteria is a challenging goal. Branched chain alkyltetralins are amongst the individual classes of components of aromatic UCMs which have been identified in hydrocarbon-contaminated sediments and a number of synthetic alkyltetralins have proved toxic in laboratory studies. Thus, alkyltetralins should perhaps be amongst the targets for UCM bioremediation strategies. The slow degradation of several alkyltetralins by a microbial consortium has been reported previously; however, the bacteria involved remain unidentified and no single strain capable of alkyltetralin biodegradation has been isolated. The present project therefore aimed to enrich and identify bacterial consortia and single strains of bacteria from a naturally hydrocarbon-contaminated site (Whitley Bay, UK), which were capable of the degradation of two synthetic alkyltetralins (6-cyclohexyltetralin (CHT) and 1-(3’-methylbutyl)-7-cyclohexyltetralin (MBCHT)). Materials and methods  Bacteria were enriched from sediment collected from Whitley Bay, UK by culturing with CHT and MBCHT for a period of 4 months. Biodegradation experiments were then established and degradation of model compounds monitored by gas chromatography–mass spectrometry. Internal standards allowed the generation of quantitative data. 16S rRNA gene clone libraries were constructed from individual enrichments to allow assessment of microbial community structure. Selective media containing MBCHT were used to isolate single bacterial strains. These strains were then tested in liquid culture for their ability to degrade MBCHT. Results  The consortia obtained through enrichment culture were able to degrade 87% of CHT and 76% of MBCHT after only 46 days compared with abiotic controls. The 16S ribosomal RNA gene clone libraries of these bacteria were dominated by sequences of Rhodococcus spp. Using selective media, a strain of Rhodococcus was then isolated that was also able to biodegrade 63% of MBCHT in only 21 days. Discussion  The present report describes the isolation of a single bacterial strain able to degrade the resistant MBCHT. Although significant losses of MBCHT were observed, putative metabolites were not detectable. Rhodococcus sp. have been reported previously to be able to biodegrade a range of hydrocarbon compounds. Recommendations and perspectives  Due to their environmental persistence and toxicity, aromatic UCMs require bioremediation. The culturing and identification of such bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins may be an important step toward the development of bioremediation strategies for sites contaminated with toxic UCMs.     

食用仙人掌萎蔫气象条件分析

塑料大棚内种植的食用仙人掌在土壤墒情较好时也有萎蔫现象发生，通过试验观测和对仙人掌生理习性的分析，发现阴雨过后天气突然放晴温度急剧上升易使仙人掌发生萎蔫现象，并提出了田间管理的应对措施。     

济南山丘区土壤侵蚀潜在危险度景观格局分析

土壤侵蚀潜在危险度景观格局的形成及其变化是自然的和人为的多种因素相互作用的结果 ,运用景观生态学原理 ,通过分析景观斑块的类型、数量、面积大小和空间组合状况 ,揭示出济南市山丘区的土壤侵蚀潜在危险度分布特征及空间变异规律     

烘焙对生物质热解产物特性的影响

烘焙可有效地降低生物质中的水分和氧,对其热解过程有显著的影响。该文主要研究了烘焙温度（200,230,260,290℃）对生物质热解过程及产物特性的影响行为及影响机制;研究发现烘焙能改善热解产物的品质,随着烘焙温度的升高,热解合成气中CO含量由48%逐渐减少到34%,CH4和H2增加,其中H2含量最大增加了77.4%,而液体产物中,乙酸和水分含量逐渐减小,水分含量最大减少了42.8%,而酚类产物的含量明显增加,有利于生物油品质的提高。该研究为烘焙技术的发展和生物质高效热化学转化提供科学参考。     

青海省耕地资源开发利用分析及对策研究

分析论述了青海省耕地资源开发利用的现状、特点和问题。在此基础上,提出了对青海省耕地资源进行研究的框架体系和思路,同时基于GIS/RS技术设计了相关的技术路线。最后依据所做设计对青海省耕地资源开发利用做了初步分析,并进行了相关的对策研究分析。     

稀释介质种类对豆乳蛋白胶体粒子zeta电位测定效果的影响

蛋白粒子zeta电位是衡量豆乳体系稳定性的一个重要指标,而在电位分析前常采用稀释介质对豆乳进行预处理。为了确保zeta电位测定的准确性和科学性,必须选择合适的稀释介质。因此,该研究采用去离子水、豆乳超滤液两种稀释介质分别对豆乳进行稀释,并比较了这2种稀释介质对zeta电位、粒径分布、pH值以及电导率的影响。结果表明,若以去离子水为稀释介质,zeta电位的绝对值会随着稀释倍数的升高而显著增加（*P<0.05）,这主要是由于豆乳蛋白胶体粒子发生解聚导致粒径减小,而pH值的升高和电导率的降低则说明豆乳的离子强度显著降低。相比之下,选用豆乳超滤液稀释豆乳时,体系的 zeta 电位、粒径分布、pH值以及电导率都未随稀释倍数的增加而改变（*P>0.05）,说明此法能够较好地维持豆乳蛋白粒子的荷电稳定性。由此可知,豆乳超滤液可做为豆乳zeta电位测定的理想稀释介质。     

8个油松种源抗旱性的比较研究

为了鉴别8个油松(Pinus tabulaeformis Carr.)种源的抗旱性,以其3年生幼苗为研究对象,进行了控水条件下的盆栽实验(T_1:土壤含水量为25%～29%;T_2:土壤含水量为19%～22%;T_3:土壤含水量为12%～15%);测定了其净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等生理生化指标,并应用Fuzzy隶属函数对它们的抗旱性进行了综合评价.结果表明,在T_3条件下,8个种源的Pn无显著差异(P＞0.05);种源2的T_r显著高于种源1,3,5(P＜0.05);种源5的水分利用效率(WUE)显著高于种源2,3,4,6,7,8(P＜0.05).与T_2条件相比,在T_3条件下,各种源的SOD活性均有所增高,多数种源的POD活性均有所增高;种源7,8膜脂过氧化程度较小,而种源1,3,4,5膜脂过氧化程度较大.8个种源的抗旱性依次为:种源8＞种源6＞种源1＞种源5＞种源4＞种源3≈种源7＞种源2.