植物翻译控制肿瘤蛋白研究进展

翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)广泛存在于各类真核生物中,是一类在进化上高度保守的同源蛋白家族。植物TCTP具有促进细胞增殖、分化和再生、对抗生物或非生物胁迫等功能,其表达受转录和翻译水平的调节,调控机理较复杂。本文从TCTP的发现与命名、研究领域与分布、植物TCTP基因的结构特点、表达特性及功能等方面进行了简要综述,旨在全面了解植物TCTP的生理生化功能,以期为进一步研究其调控机理,调控植物生长发育和培育抗逆新品种提供一定的理论参考。     

小麦翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)与索马甜类蛋白(TLP)的相互作用

翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)分布于真核细胞中,参与包括有丝分裂、DNA损伤修复和植物抵御病原物侵染等多种生物进程。索马甜类蛋白(thaumatin-like protein,TLP)是一类植物中的病程相关蛋白,参与多种植物响应病原物侵染的过程。本实验室前期研究证明Ta TCTP参与小麦(Triticum aestivum)抵御小麦叶锈菌侵染(Puccinia triticina)的防卫反应。本研究关注小麦Ta TCTP和Ta TLP之间的相互作用,分别构建了用于酵母双杂交(yeast two-hybrid)和双分子荧光互补(Bi-molecular fluorescence complementation,Bi FC)实验的载体。通过酵母双杂交实验,发现同时携带表达TCTP和TLP载体的酵母AH109可以在SD-Leu/-Trp/-His和SD-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上生长,并可检测到报告基因α-半乳糖苷酶基因(α-galactosidase gene,MEL1)活性,表明Ta TCTP和Ta TLP可发生物理互作。通过Bi FC实验,发现共同转化表达TCTP和TLP载体的烟草(Nicotiana benthamiana)下表皮细胞的细胞质中可观察到强烈的黄色荧光,表明Ta TCTP和Ta TLP可在细胞质中发生相互作用。本研究为深入研究TCTP在小麦抵抗小麦叶锈菌侵染中的作用机制奠定基础。     

葡萄糖和含腺苷分子通过碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)诱导猪脂肪细胞硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)的表达

硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)是一种氧化还原调节蛋白,通过与硫氧还蛋白结合抑制其活性,调节细胞的氧化还原状态,在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用。本研究利用从3~7日龄仔猪(Sus scrofa)皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,应用RNAi沉默碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达,以含0或0.1 mmol/L NAD+的葡萄糖浓度分别为0、5和15 mmol/L的培养液培养,采用实时荧光定量PCR检测Txnip及ChREBP mRNA表达,以探讨葡萄糖和含腺苷分子对猪脂肪细胞Txnip表达的影响及其转录调控途径。结果表明,葡萄糖以浓度依赖方式促进猪脂肪细胞Txnip和ChREBP mRNA表达,无糖条件下NAD+对Txnip mRNA表达没有明显影响,但葡萄糖存在时显著促进其表达。siRNA沉默脂肪细胞ChREBP表达后,葡萄糖对Txnip mRNA表达的促进作用比相同条件下培养的对照细胞有较大幅度降低;以NAD+处理后,Txnip表达在葡萄糖浓度为5和15 mmol/L时分别较对照细胞降低了91%和93%。由此说明,NAD+诱导猪脂肪细胞Txnip转录表达依赖于葡萄糖的参与,ChREBP介导葡萄糖和NAD+对Txnip mRNA表达的诱导作用。研究结果为进一步探讨ChREBP在葡萄糖和脂质稳态中的作用提供了基础。     

精原细胞分化与凋亡的影响因素

人们对哺乳动物精子发生过程已经有了相当多的了解，但对精子发生过程的调控机制仍然了解甚少。生殖激素及原癌基因和肿瘤抑制基因的表达产物对维持正常精子发生中各类细胞的存活、增殖和凋亡，以及各类细胞受损伤后的清除均具有十分重要的作用。本文论述了促卵泡激素、雌激素、雄激素、干细胞因子、Bcl-2家族蛋白及p53蛋白在原细胞的分化和凋亡中的作用，以便人们进一步了解精子发生的调控机制。     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)启动子的克隆与表达

为探明小金海棠(Mdus xiaojinensis)类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)的表达和调控机制,应用Tail-PCR技术从小金海棠中克隆了翻译起始位点上游891 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件、乙烯应答元件、赤霉素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件.以GFP为报告基因,构建了含MxYSL5基因启动子的植物表达载体MxYP5-GFP.将MxYP5-GFP用基因枪法转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,瞬时表达结果表明,该启动子能够驱动GFP在洋葱表皮细胞中的表达,可以用于MxYSL5的表达示踪.     

结球甘蓝转录调控肿瘤蛋白基因（TCTP）的分离与表达特性初步分析

TCTP（translationally controlled tumor protein）是许多动物肿瘤细胞中存在的一类较丰富的蛋白（Yenofsky et al.1983），目前为止，有关TCTP的确切功能还不是很清楚，推测TCTP可能是属于对热较为稳定的钙结合蛋白（Kim et al．，2000），能够结合微管蛋白（Gachet et al．，1999），诱导细胞内的信号传递（MacDonald et al．,1995），同时细胞增殖有关（Bohm et al.,1989）。     

高温诱导体外培养奶牛乳腺上皮细胞的应激响应

实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究不同时间高温(42℃)热处理对细胞热休克蛋白HSP、细胞凋亡、乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA表达丰度的影响.结果发现,热休克转录子hsf-1和热休克蛋白基因hsp27、hsp70和hsp90在高温处理0.5 h后mRNA表达上调,其中hsp70转录水平有急剧上调过程,且随热处理时间延长均表现出先上升后下降的趋势;标志细胞凋亡的Bax基因从处理的0.5 h开始mRNA表达下调,随后升高;但细胞凋亡Bcl-2 mRNA表达上调;在检测的热处理过程中,αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因转录先上调后下降,而β-酪蛋(CSN2)和嗜乳脂蛋白(BTN)基因转录均下调;与脂肪酸合成和调控相关的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、过氧化物酶激活受体.-γ(PPARG)和固醇调节元件转录因子-1(SREBF-1)基因表达显著上调,而过氧化物酶激活受体-α(PPARA)基因mRNA转录没有明显变化.本实验结果证明热应激诱导了奶牛乳腺上皮细胞的应激反应,对细胞的乳蛋白和乳脂肪合成功能产生了显著影响,细胞产生热耐受.     

表达人CD47基因的巴马小型猪创建及其表达分析

异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应.     

StAR蛋白在仔猪睾丸组织中的表达*

以1-5周龄的仔猪睾丸为研究对象，采用免疫组化法和放射免疫法(RIA)研究了类固醇合成快速调节蛋白(StAR protein)在仔猪睾丸的表达及StAR蛋白与血浆睾酮水平的关系。实验结果表明：在1～5周龄，StAR蛋白主要在仔猪睾丸的间质细胞中表达；其中1、3周龄StAR蛋白的表达水平较低；2、4周龄StAR蛋白的表达水平较高，5周龄StAR蛋白的表达水平低于2、4周龄，但比1、3周龄强。睾酮水平在第2、3周时最高，在其它时期较低。StAR的表达与睾酮水平的变化并不完全一致。     

CDK1和CyclinB1在不同月龄绵羊睾丸中的表达与定位

哺乳动物精母细胞减数分裂至成熟受蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK1)和细胞周期蛋白B(CyclinB1)形成的复合物细胞促分裂因子(maturation promoting factor,MPF)控制.本实验选取0、2、6、12和24月龄绵羊(Ovis aires)睾丸组织,探究了不同月龄绵羊睾丸中CDK1和CyclinB1表达与定位情况.通过qRT-PCR方法检测了CDK1和CyclinB1在不同月龄绵羊睾丸中mRNA表达情况,并利用免疫组织化学染色技术对睾丸组织中CDK1和CyclinB1蛋白定位.结果表明,绵羊睾丸中CDK1和CyclinB1 mRNA表达量随月龄的增加呈现先下降后上升的趋势.CDK1和CyclinB1蛋白在细胞中主要定位于精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞.各发育期CDK1蛋白表达量均低于CyclinB1蛋白的表达量,其中CDK1蛋白在整个细胞周期中表达量极少且相对稳定,CyclinB1蛋白在各发育期表达量不同.说明CDK1和CyclinB1 mRNA和蛋白质在不同月龄绵羊睾丸中的表达量存在一定差异,可能对绵羊睾丸发育有一定的调节作用.     

Protein changes in the albedo of citrus fruits on postharvesting storage

In this work, major protein changes in the albedo of the fruit peel of Murcott tangor (tangerine x sweet orange) during postharvest ageing were studied through 2D PAGE. Protein content in matured on-tree fruits and in fruits stored in nonstressing [99% relative humidity (RH) and 25 degrees C], cold (99% RH and 4 degrees C), and drought (60% RH and 25 degrees C) conditions was initially determined. Protein identification through MS/MS determinations revealed in all samples analyzed the occurrence of manganese superoxide dismutase (Mn SOD), actin, ATP synthase beta subunit (ATPase), citrus salt-stress associated protein (CitSap), ascorbate peroxidase (APX), translationally controlled tumor protein (TCTP), and a cysteine proteinase (CP) of the papain family. The latter protein was identified in two different gel spots, with different molecular mass, suggesting the simultaneous presence of the proteinase precursor and its active form. While Mn SOD, actin, ATPase, and CitSap were unchanged in the assayed conditions, TCTP and APX were downregulated during the postharvest ageing process. Ageing-induced APX repression was also reversed by drought. CP contents in albedo, which were similar in on- and off-tree fruits, were strongly dependent upon cold storage. The active/total CP protein ratio significantly increased after cold exposure. This proteomic survey indicates that major changes in protein content in the albedo of the peel of postharvest stored citrus fruits are apparently related to the activation of programmed cell death (PCD).     

乙肝病毒X蛋白结合蛋白最新研究进展

乙肝病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）是肝细胞癌变过程的一个关键因素,它能在动物肌肉组织和恶性肿瘤组织中过表达。近年来研究显示：HBXIP能与人体内多种蛋白结合。本文综述了HBXIP蛋白参与细胞凋亡与增殖、细胞周期进程、中心体复制、肿瘤细胞迁移等过程,以期为以HBXIP蛋白为靶标的新的抗乙肝病毒等药物设计提供基础。     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单克隆抗体的制备及潜在应用

制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以纯化复性的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾细胞与SP2/0细胞融合,ELISA筛选出了4株分泌Pm OmpA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5D2、BC11、2A2和6A4。其中2A2细胞培养液效价为1∶256,5D2、BC11和6A4效价为1∶128;2A2腹水效价为1∶12800,其余3株达1∶6400。杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体。Western blot显示,4株单克隆抗体均能与Pm OmpA重组蛋白重组发生特异性反应。用ELISA方法鉴定2A2单克隆抗体亚型为IgG2b,Protein A亲和纯化2A2腹水抗体,获得的单抗浓度为130μg/mL。选取纯化的2A2单克隆抗体进行潜在应用研究,Western blot与间接免疫荧光结果显示,单克隆抗体能与兔多杀性巴氏杆菌分离菌株发生特异性反应。表明利用体外重组表达兔多杀性巴氏杆菌OmpA融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体,可用于兔多杀性巴氏杆菌诊断,本研究结果为兔多杀性巴氏杆菌诊断试剂盒的研制提供技术参数。     

木薯蚕五龄至化蛹蚕蛋白质代谢的研究

本文报道木薯蚕南一品种,从五龄起蚕至化蛹第一天血液蛋白质含量的动态变化。五龄起蚕血液蛋白质含量为30.4mg/ml,摄食木薯叶一天后,反而略有下降,为29.2mg/ml,第三天后回升,第五天开始急剧直线上升,吐丝时达最高量96.4mg/ml,为起蚕时含量的三倍多,预蛹期逐渐下降,化蛹第一天下降幅度最大。电子显微镜观察五龄第四天脂肪体细胞,细胞质内只见脂肪球,未见蛋白质颗粒。证明五龄期脂肪体合成蛋白质后释放到血液中,化蛹期血液蛋白质又转输入脂肪体,脂肪体由合成蛋白质部位转变为蛋白质贮藏部位,符合昆虫变态与蛋白质代谢的规律。     

Changes in proline-14C metabolism in barley seedlings germinating at low temperature

Changes in the metabolic pattern of proline-¹⁴C were examined in barley seedlings germinated at the low temperature of 2°C (LT) and compared with those germinated at 25°C (HT). In the LT shoots. proline-¹⁴C incorporation was higher in the cationic fraction and lower in the acid-neutral fraction than that of HT, respectively. More proline-¹⁴C of LT was converted to other amino acids, especially to acidic amino acids in free amino acid state, than was the HT proline-¹⁴C which had a comparatively wide distribution.

In the LT protein fractions. more proline-¹⁴C was incorporated into the cytoplasmic protein than into the cell wall protein. On the contrary, the radioactivity of the lIT cell wall increased more distinctively. proline-¹⁴C in the two proteins of LT was a little less converted to other amino acids than in those of HT. A little higher radioactivity was found in the aspartate and glutamate of the LT protein hydrolysates. The hydroxyproline which is closely related with proline had a little lower level of radioactivity in the LT cell wall.     

用于药用蛋白生产的外源表达系统

利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的药用蛋白是现代生物技术产业的核心内容和研究热点,也是各国政府和制药企业竞相巨额资助的研究领域之一。本文综合分析了目前用于重组药用蛋白生产的原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统在表达产量、翻译后加工能力、生产周期、生产成本、适用范围等方面的优劣以及研究现状和最新研究进展,揭示出植物表达系统将在未来重组蛋白大规模生产中占据重要地位。但是现有的各种表达系统都无法单独实现各种重组蛋白高活性、低成本、安全系数高的大规模生产。在相当长时间里,各种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存。而通过遗传改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能,不断建立更加优越的外源蛋白表达系统则是大家共同努力的目标。     

松材线虫及其近缘种热激蛋白90基因(hsp90)克隆与序列分析

热激蛋白90家族(heat shock protein 90(HSP)family)是一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用。本研究用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)和豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchus doui)热激蛋白90基因的cDNA全长序列,分别命名为Bx-hsp90、Bm-hsp90和Bd-hsp90,(GenBank登录号分别为:GU013561、HMO34943和HM347331),其cDNA全长分别为2255、2193和2232bp,开放阅读框均为2127bp,编码708个氨基酸,5'端非编码区的长度分别为33、13和13bp,3'端非编码区的长度分别为95、53和92bp。其DNA全长分别为2440、2388和2407bp,包含3个内含子。三者氨基酸序列的一致性为98.78%。进化分析表明,松材线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫与秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的亲缘关系较近,推测三...     

施氮量对冬小麦蛋白质品质和面粉色泽的影响

为探明不同施氮量对小麦籽粒产量、蛋白质含量及蛋白质组分、面粉色泽的调控效应,明确蛋白质含量及蛋白质组分与面粉色泽间的关系,在河南郑州进行了两年2种筋力型小麦品种（郑麦366和矮抗58）不同施氮水平的定点试验。结果表明,小麦籽粒产量、蛋白质产量和蛋白质含量均随施氮量的增加显著增加,两年结果表现一致。强筋小麦郑麦366产量和品质均提高的最佳施氮量为N 225 kg/hm2,而中筋小麦矮抗58为N 150~225 kg/hm2。蛋白质各组分随施氮量增加的变幅因品种不同存在差异。随施氮量增加两个小麦品种的面粉色泽亮度（L*值）降低,红度（a*值）增加。相关分析表明,面粉色泽亮度（L*值）与蛋白质和醇溶蛋白含量呈显著负相关（P0.05）,红度（a*值）与蛋白质及各蛋白质组分含量呈极显著正相关（P0.01）,黄度（b*值）仅与球蛋白含量呈极显著负相关（P0.01）。因此,施氮量显著影响小麦的籽粒产量和蛋白质含量,施氮量对面粉色泽的影响在不同品种和不同年度间存在差异。