小金海棠Fe3+-螯合还原酶MxFRO2基因启动子的克隆与表达分析

通过染色体步移法从小金海棠（Malus xiaojinensis）基因组中克隆了三价铁螯合还原酶（ferric chelate reductase, MxFRO2）基因翻译起始位点上游1 738 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件G-box、生长素应答元件、铜元素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。从TAIR网站获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中8个FRO基因上游的启动子序列,通过PlantCARE分析了其与MxFRO2启动子的异同。根据在线预测结果,克隆了翻译起始位点上游1 644 bp（MxFul）和259 bp（MxD1）两段序列,构建了其与GFP融合的瞬时表达载体,并将重组质粒通过PEG介导法分别转化拟南芥叶片原生质体,结果表明,小金海棠MxFul和MxD1两段启动子序列都能驱动GFP蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达。     

小金海棠MxYSL1基因的克隆与表达分析

小金海棠属于铁高效基因型。为了研究小金海棠的抗缺铁分子机理,根据苹果的EST库得到一个791 bp的YSL(yellow stripe 1-like protein)基因片段序列,设计特异引物,在苹果铁高效基因型小金海棠（Malus xiaojinenesis）中克隆到此基因片段。3'-RACE得到YSL基因的3'端序列,拼接后得到1 114 bp的3'端基因序列。预测该基因片段编码一个含7个跨膜区的蛋白多肽,与拟南芥AtYSL1同源性达74%,命名为MxYSL1。RT-PCR及Northern blot分析表明,该基因在小金海棠各个检测部位都有表达。在根、茎与成熟叶中,该基因在低铁(EDTA-NaFe,4 μmol/L)时减弱表达,在过量铁(EDTA-NaFe,320 μmol/L)供应时增强表达。MxYSL1基因在新叶中的表达趋势与以上器官中的表达趋势正好相反。     

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子功能区的缺失分析

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子(Arachis hypogaea promoter of β-1,3-glucanase,Ah-Glu-Pro)属于诱导型的启动子.为分析该启动子序列中对外源信号分子响应的重要顺式调控元件,利用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,TAIL-PCR)方法扩增得到长度为970 bp的Ah-Glu-Pro序列.PLACE和PlantCARE在线预测结果表明,该启动子序列中含有对病原菌及水杨酸(salicylic acid,SA)响应的顺式调控元件,如GRWAAW、GTl-motif、W-box、RAV lAAT、INRNTPSADB、AMMORESIVDCRNIA1和BIHD 1OS.根据预测结果,在5’端设计5个正向引物Glu-F、Glu-P4、Glu-P3、Glu-P2和Glu-P1,3’端设计一个反向引物Glu-R,5个引物对扩增得到该启动子序列Ah-Glu-P以及5'端4个缺失片段Ah-Glu-P4～Ah-Glu-P1,长度分别为931、767、650、376和217 bp.将这5个片段分别克隆到pCAMBIA 1301-xylA载体中,构建以木糖异构酶基因(xylose isomerase gene,xylA)作为安全筛选标记、以β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene,GUS)作为报告基因的相应5个植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-Glu-P～pCAMBIA 1301-xylA-Glu-P1.将这5个表达载体分别转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,进行GUS蛋白组织化学染色及GUS酶活性检测,结果表明,经SA诱导后,转入Ah-Glu-P～Ah-Glu-P3 3个载体的洋葱表皮细胞中的GUS酶活性分别提高1.45、2.16和1.27倍,转入Ah-Glu-P2～Ah-Glu-P1载体的洋葱表皮细胞在SA诱导前后GUS酶活性无明显差别.结合软件预测结果推测,在启动子Ah-Glu-P、Ah-Glu-P4和Ah-Glu-P3内部存在的RAV1 AAT、MYBCOREATCYCB1和INRNTPSADB为对SA响应的正调控元件;在Ah-Glu-P～Ah-Glu-P4之间存在的GT1-motif和AMMORESIVDCRNIA1为对SA响应的负调控元件.对这些重要顺式调控元件功能的进一步确认将为通过调控实现花生内源β-1,3-葡聚糖酶基因的高效表达、提高花生(Arachis hypogaea)的抗病性、以及在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据.     

玉米In5-2启动子功能区域在洋葱瞬时表达系统中的分析

本研究旨在通过对根癌农杆菌侵染洋葱表皮细胞的条件进行优化,从而建立一种新的瞬时表达系统,并将其应用于玉米In5-2启动子的功能区域的分析中,明确In5-2启动子的乙酰苯胺类化合物诱导元件的具体位置.在本研究中采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染洋葱(Allium cepa)表皮细胞,对转β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬时表达进行研究,并分析了侵染液中乙酰丁香酮(As)的浓度、侵染时间、菌液浓度、共培养时间对GUS基因的瞬间表达的影响.结果显示,在OD600值为0.8的农杆菌液中感染15 min,共培养3 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达,从而建立了一种新的瞬间表达系统.同时,构建了含不同长度的玉米(Zea mays)In5-2启动子片段缺失载体,利用新的瞬时表达系统分析其功能区域,推测出乙酰苯胺类化合物诱导元件位于ATG上游-220～-143 bp之间.结果表明新的瞬时表达系统可以快速有效地进行启动子的分析.     

小金海棠质膜H+-ATPase基因(MxHA2)的克隆及功能分析

植物质膜H+-ATPase能把质子泵出根外酸化土壤,增加铁的溶解度,利于植物对铁的吸收.小金海棠是一个苹果铁高效基因型砧木,为研究质膜H+-ATPase在小金海棠铁吸收过程中的功能,本研究通过同源克隆的方法从小金海棠(Malus xiaojinensis)中克隆到了一条全长2865 bp含有完整编码区的质膜H+-ATPase基因(MxHA2),编码954个氨基酸(GenBank登录号:JQ867095).系统进化分析结果表明MxHA2蛋白与碧桃(Prunus persica)的PPA2蛋白亲缘关系较近.基因枪法在洋葱(Allium cepa)表皮内进行亚细胞定位分析,结果表明,MxHA2与GFP的融合蛋白定位于细胞膜上.荧光定量PCR分析表明,缺铁胁迫后,MxHA2基因在根和叶中均有不同程度的增强.把MxHA2基因转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(BJ2168)后,转MxHA2的酿酒酵母H+-ATPase活性极显著增强,且缺铁处理后其生长量持续高于对照,表明该基因编码的蛋白具有H+-ATPase活性,其过量表达能提高酵母菌株的耐缺铁性.结果提示,MxHA2可能在小金海棠的耐缺铁胁迫过程中起重要作用,为进一步研究小金海棠的铁高效机理提供了依据,在果树耐缺铁分子育种上有重要的应用前景.     

通用型植物表达载体pCamE的构建及功能验证

为了探索通用型植物表达载体的快捷构建,本研究通过PCR克隆、酶切连接和PCR扩增获得CaMV 35S启动子序列及pUC19多克隆位点部分限制性内切酶位点和NOS终止子,构建成完整的表达组件,并将该组件插入pCAMBIA1300的多克隆位点,构建成通用型植物表达载体pCamE(GenBank登录号:JX841315)。pCamE表达组件的启动子上游、多克隆位点和终止子下游分别含有4、8和3个单拷贝限制性内切酶位点,利于外源基因的克隆和插入以及对载体启动子或终止子的修饰和更换。以绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,eGFP)为报告基因,分别构建了表达载体pCam::GFP、pCam::SalGFP和pCam::DAHPS-GFP,转化洋葱(Allium cepa L.)表皮细胞和拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),绿色荧光蛋白(GFP)和融合蛋白DAHPS-GFP在洋葱表皮细胞中均成功稳定表达;在pCam::GFP转基因拟南芥株系的根、根尖、根毛、茎表皮毛、幼叶基部、叶柄微管组织和未成熟花药等组织均能观察到强烈的绿色荧光。表明,植物表达载体pCamE是可将不同目的基因与植物染色体整合并稳定遗传的通用型植物表达载体,不受外源片段大小及插入位点的影响,具有经济实用、适用广泛、操作简便和外源基因在转基因植物中遗传稳定且正常表达等特点。该载体可用于不同基因和不同功能表达载体的快捷构建,为植物的遗传转化和基因功能研究提供了新的通用型基因表达载体工具。     

小麦TaGAPC1基因及其启动子的克隆与功能分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是糖酵解过程中的关键酶。作为GAPDH的亚型,GAPC(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,但是关于GAPC在非生物胁迫应答中作用的研究却并不充分。本研究从中国春小麦(Triticum aestivum)中克隆出了TaGAPC1基因(GenBank No. KU246046),其编码337个氨基酸,并克隆出基因上游973 bp的序列,将其命名为P973。通过融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因,使用基因枪法瞬时转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞进行亚细胞定位,结果显示TaGAPC1蛋白定位于细胞膜上。使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术,分析TaGAPC1基因在根、茎、叶中,以及干旱(PEG8000)、盐(NaCl)、脱落酸(abscisic acid, ABA)和低温(4℃)非生物胁迫下的表达模式。结果表明TaGAPC1基因在叶、根、茎中的表达量依次下降,在PEG8000、NaCl和ABA胁迫下的表达量显著上升,但对4℃的响应不明显。根据PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库分析,P973启动子序列中包含响应干旱、ABA、低温和创伤等胁迫的顺式作用元件,如干旱应答元件(drought-responsive element,DRE)、激素应答元件包括ABA应答元件(ABA-responsive element, ABRE)、MYB结合位点(MYB-binding site, MBS)和WUN-motif等。根据顺式作用元件的分布,扩增得到5个启动子5'端缺失片段,分别命名为P844、P738、P605、P475和P256。构建6条启动子序列融合β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase, GUS)的表达载体,并瞬时转化烟草(Nicotiana batacum)植株,测定PEG8000、NaCl、ABA和4℃胁迫下各启动子驱动的GUS酶活。结果表明,-973~-605启动子区域在TaGAPC1基因应答PEG8000和NaCl胁迫中具有关键作用,-973~-475启动子区域对应答ABA胁迫至关重要。本研究从分子水平初步阐释了TaGAPC1与非生物胁迫应答的关系,为深入探讨其抗逆的分子机制奠定了基础。     

苹果属山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)的克隆及表达分析

为了研究不同铁效率基因型苹果砧木铁吸收利用的分子机理,本研究以铁低效基因型山定子(Malus baccata Borkh)为试材,根据实验室从铁高效基因型小金海棠(Malus xiaojinensis)克隆到与铁运输相关的基因柠檬酸合成酶基因(MxCS1)的全长序列设计特异引物,通过RT-PCR方法从山定子cDNA中克隆到柠檬酸合成酶基因CS,基因全长为1422bp,与金冠(Malus domestica Borkh cv.Golden Delicious)、小金海棠中的CS基因具有较高的同源性,将该基因命名为MbCS1(GenBank登录号:JQ898346)。利用生物信息学软件对山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)进行预测分析,结果显示该基因预测编码473个氨基酸,相对分子量为54.26kD,理论等电点为8.95。亚细胞定位显示MbCS1蛋白定位在细胞膜上。半定量RT-PCR及Real-time PCR分析均表明,正常供铁时,该基因在山定子的根、茎、新叶中都有表达;缺铁处理(EDTA-NaFe,4μmol/L)时,该基因在根、茎和新叶中的表达加强,第9天达到最高值,之后开始下降;但各检测器官中表达增强的程度不同,其中茎中受缺铁诱导表达最明显。与小金海棠中MxCS1基因的表达趋势有明显的差别。本研究为高等植物抗性机理的深入研究以及铁低效资源型砧木资源的改良提供了基础资料。     

橡胶树hbYKt基因植物表达载体构建及亚细胞定位

SNAREs（soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白受体）参与囊泡运输,在植物中具有非常广泛和重要的生物学功能。我们从橡胶树胶乳消减cDNA文库中筛选获得橡胶树的SNARE基因,命名为hbYKt。为进一步研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达栽体pCAMBIAl304h-bYKt,通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞。荧光显微镜检测结果表明hbYKt定位在洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞的细胞质膜中。     

适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究.